Süper çözünürlüklü hücre altı dünyasına niceliksel bir bakış

Bu araştırma, on yılı aşkın bir süredir peşinden koştuğumuz ana soruya yönelik ilerici bir adımı temsil ediyor: Uzay-zamansal çözünürlüğü geliştirirken ve görüntülü yapıların bütünlüğünü korurken, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) yeniden yapılandırma eserlerini tamamen ortadan kaldırmak mümkün mü? Hesaplamalı bir teknik olarak SIM, eserlere eğilimli süper çözünürlüklü (SR) görüntüler oluşturmak için yeniden yapılandırma aşamasına dayanır. 2018’de, SIM’in Wiener ters filtre kaynaklı rastgele gürültü amplifikasyonunun neden olduğu içsel eserlere duyarlılığını vurguladık, bu nedenle bu yapıları azaltmak için uzay-zamansal sürekliliği kullanmayı önerdik.1. 2021’de, başka bir evrensel ön bilgi olarak floresan görüntülerinin seyrekliğini kullanan seyrek ters evrişim algoritmasını geliştirerek canlı hücre SR görüntülemenin uzay-zamansal yeteneklerini daha da geliştirdik (daha fazla bilgi için şu adresteki önceki blog gönderimize bakın: https://bioengineeringcommunity.nature.com/posts/sparse-deconvolution-one-decisive-step-into-computational-fluorescence-superDefinition). Sparse SIM kullanarak, 564 Hz örnekleme hızında 70 nm’nin altında bir çözünürlüğe başarıyla ulaştık. Bu, nükleer zar içindeki çeşitli boyutlarda nükleer gözenekleri ve canlı hücrelerdeki karmaşık aktin ağlarının ve yapılarının dinamik davranışını gözlemlememize izin verdi.2.

Yine de, çözünürlüğü ve karşıtlığı önemli ölçüde artırarak, belirli yapı türlerini bastırmada uzay-zamansal süreklilik ön bilgisinin yetersizliğini keşfettik. Örneğin, Wiener-SIM kullanılarak elde edilen çok sayıda SR görüntüsü kabul edilebilir görünüyordu; ancak, çözünürlüğü daha da artırmak için seyrek ters evrişim algoritması uygulandığında zaman zaman periyodik eserler ortaya çıktı. Bu, bazı kullanıcıların seyrek ters evrişimin ara sıra yapıtları “tetiklediğini” iddia etmelerine yol açtı. Gerçekte, bu fenomen, periyodik eserler için uzay-zamansal süreklilik ve seyreklik ön bilgisinin birleşik ilişkisine atfedilebilir. Bu eserler, Wiener rekonstrüksiyonu ile tamamen ortadan kaldırılmadı ve ardından seyrek ters evrişim süreciyle güçlendirildi.

Önemli periyodik eserler sergileyen hücreleri inceledikten sonra, bu eserlerin yüksek veya homojen olmayan arka plan floresansı nedeniyle üretildiğini keşfettik. Bu sorun, düşük frekanslı arka plan sinyallerinin yüksek frekanslı spektruma yanlış geçişinden kaynaklanır ve SIM yeniden yapılandırması sırasında periyodik eserlere neden olur. Bu sorunu ele almak için iki yaklaşım önerilmiştir: 1) ham görüntülerden doğrudan arka plan floresansının çıkarılması veya 2) frekans alanındaki hatalı sinyali ortadan kaldırmak için bir çentik filtresinin kullanılması. Bununla birlikte, her iki yöntemin de zorlukları vardır. Arka plan flüoresansının çıkarılması, zayıf yeniden oluşturulmuş sinyalleri istemeden ortadan kaldırabilir. Aynı zamanda çentik filtresi yaklaşımı (NF-SIM’de kullanıldığı gibi)3, 4/HiFi-SIM5), aynı görüntüleme parametreleri altında yakalandığında bile, farklı organel görüntüleri için ampirik parametre ayarlamaları gerektirir. Ayrıca, her iki teknik de floresan sinyallerin yorumlanmasını karmaşıklaştıran, yeniden yapılandırma sonrası doğrusal olmayan yoğunluk değişikliklerini ortaya çıkarabilir.

Bu nedenle, kantitatif ve yüksek doğrulukta bir canlı hücre SR görüntüleme yönteminin aşağıdaki dört kriteri karşılaması gerektiğini öneriyoruz:

  • Şeffaflık ve tekrarlanabilirlik: Bu, farklı araştırmacıların aynı parametreleri kullanarak aynı sonuçları elde etmesini sağlar.
  • Minimum (veya sıfır) yeniden yapılanma artefaktları ve hataları: Bu, yeniden yapılandırılmış yapıların doğruluğunu ve güvenilirliğini garanti eder.
  • Uzamsal çözünürlük ile flüoresan yapıların bütünlüğü arasındaki denge: Etkili bir SR yöntemi, zayıf sinyalleri korurken yüksek çözünürlük sunmalıdır.
  • Yeniden yapılanma, işlenmiş floresan sinyalinin doğrusallığını korumalıdır: Bu, doğru floresan sinyal yorumlamasının önemini vurgulamaktadır.

Bu kriterleri göz önünde bulundurarak, arka planı kaldırmak için fiziksel model tabanlı bir yaklaşım benimsemeye karar veriyoruz.6. Kamera tarafından yakalanan görüntülerin, karşılık gelen nokta yayma işleviyle evrişimli farklı numune derinliklerinde uyarılan flüoresansın toplamı olduğu göz önüne alındığında, evrilmiş odak içi ve odak dışı emisyonu ayırıp ayıramayacağımızı merak ediyoruz (Şekil 1). Odak dışı düzleminkine (O(r, Zout) yaklaşmak için odak düzlemi (o(r, Zin) içindeki flüoresan özneyi kullanarak, SIM’in yeni bir görüntü oluşturma modelini elde ettik.

burada ben(r) aydınlatma için sinüzoidal yoğunluk modelidir ve h(r, Zin) ve h(r, Zout), odak içi ve odak dışı aralık içindeki PSF’lerdir. Böylece, gerçek sinyalleri azaltmadan arka plan sinyalini kaldırabiliriz.

1. Çizim, çeşitli katmanlardan (solda) floresan emisyonunun entegrasyonunu ve eksenel eksen boyunca hem odak içi hem de odak dışı koşullar için simüle edilmiş nokta yayılma fonksiyonu (PSF) profilini göstermektedir.

Yeni arka plan filtreleme (BF) yöntemini içeren BF-SIM, frekans spektrumundaki hatalı noktaları etkili bir şekilde ortadan kaldırır ve hem Wiener-SIM hem de Seyrek SIM görüntülerindeki periyodik bozulmaları azaltır (İncir. 2). Ayrıca BF-SIM, performans açısından Wiener-SIM ve HiFi-SIM’i geride bırakarak gelişmiş kontrastlara sahip SR aktin filamentleri üretir. Yöntem ayrıca, hızlandırılmış görüntüleme ile kanıtlandığı gibi, zayıf aktin dallarını güvenilir bir şekilde algılar (İncir. 2). Genel olarak, BF-SIM yeniden yapılandırması, Wiener-SIM ile karşılaştırılabilir ve HiFi-SIM’den daha üstün bir doğrusallık düzeyi sergiledi (Şek. 3). Son olarak, BF-Sparse-SIM’in performansını arka planı ortadan kaldırmak için Wavelet’ler kullanan Sparse-SIM ile karşılaştırmak için yoğun şekilde etiketlenmiş aktin filamentleri ve kafesler kullandık (Dalgacıklar-Sparse-SIM) (Şekil 4). Her iki teknik de yaklaşık olarak 70 nm’nin altında çözünürlüğe ulaşmış olsa da, BF-Sparse-SIM için aktin filamentleri boyunca floresan yoğunluğu dalgalanmalarındaki varyans, Wavelets-Sparse-SIM için olanın yalnızca yarısı ila dörtte biri kadardı, bu da daha zayıf sinyallerin daha sürekli olduğunu gösteriyor. Daha kapsamlı yapıların tespit edilmesiyle uyumlu olarak, BF-Sparse-SIM ile ölçülen aktin filamentlerinin yoğunluğu ve ortalama uzunluğu 1,5 ila 2,5 kat arttı.

incir. 2. BF ön işleme, frekans spektrumundaki hatalı noktaların kaldırılmasını sağlar, sabit model yapılarını bastırır ve zayıf sinyalleri tutar.

Şek. 3. Wiener-SIM, HiFi-SIM ve BF-SIM altında yeniden oluşturulan farklı flüoresan yoğunluklarına sahip lipid damlacıkları.

4. BF-Sparse-SIM, Waveletes-Sparse-SIM’den daha yüksek doğruluk ve daha eksiksiz yapılara sahip aktin filamentleri ve ağlar sağladı.

Özetle, burada, seyrek ters evrişim ile çözünürlük sınırını zorlarken yapaylıkları en aza indiren ve sinyal doğrusallığını ve yapısal bütünlüğü sağlayan fiziksel model tabanlı bir arka plan filtreleme yöntemi önerdik. İlginç bir şekilde, bu araştırma aynı zamanda flüoresan görüntülemede temel bir soruyu da ele alıyor – farklı yöntemlerin değişen flüoresan değerlerine yol açabileceği göz önüne alındığında, hangi arka plan işleme yönteminin daha doğru ve temel gerçeğe daha yakın olduğu nasıl belirlenebilir?7 Bu, önerilen yöntemin diğer geniş alan floresan mikroskopi görüntülerini işlemek için de kullanılabileceği anlamına gelir. Bununla birlikte, SIM mikroskobundaki artefaktları ortadan kaldırmak için mevcut yöntemler yeterli değildir. Farklı organellerin, sitozole kıyasla farklı yansıtma indekslerine sahip olduğu zaten bilinmektedir.8desen aydınlatmasında yerel bozulmalara ve çeşitli düzlemlerde müteakip eserlere neden olur9. Gelecekte araştırmacılar, uzay-zamansal çözünürlüğü geliştirirken ve görüntülenen yapıların bütünlüğünü korurken, SIM rekonstrüksiyon eserlerini tamamen ortadan kaldırmak için çaba göstermeye devam etmelidir.

Referans:

  1. Huang, X. ve ark. Hessian yapılı aydınlatma mikroskobu ile hızlı, uzun vadeli, süper çözünürlüklü görüntüleme. Doğa biyoteknolojisi 36451-459 (2018).
  2. Zhao, W. ve ark. Seyrek dekonvolüsyon, canlı hücreli süper çözünürlüklü floresan mikroskobunun çözünürlüğünü geliştirir. Doğa biyoteknolojisi 40606-617 (2022).
  3. Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W. & Huser, T. ImageJ’de süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu verilerinin açık kaynaklı görüntü rekonstrüksiyonu. Doğa iletişimi 710980 (2016).
  4. Wicker, K., Mandula, O., Best, G., Fiolka, R. & Heintzmann, R. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu için faz optimizasyonu. optik ekspres 212032-2049 (2013).
  5. Wen, G. ve ark. Nokta yayılımlı fonksiyon mühendisliği ile yüksek doğrulukta yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu. Işık, bilim ve uygulamalar 1070 (2021).
  6. Mo, Y. ve ark. Fiziksel model tabanlı bir arka plan filtreleme algoritması aracılığıyla kantitatif yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, aktin dinamiklerini ortaya çıkarır. Doğa iletişimi 143089 (2023).
  7. Aaron, J. & Chew, TL Dijital görüntü işlemede doğru raporlama için bir rehber – kantitatif analizinizi herhangi biri yeniden üretebilir mi? Hücre bilimi dergisi 134 (2021).
  8. Dong, D. ve ark. Süper çözünürlüklü floresan destekli kırınım hesaplamalı tomografi, hücresel organel interaktomunun üç boyutlu manzarasını ortaya koyuyor. Işık, bilim ve uygulamalar 911 (2020).
  9. Mo, Y., Feng, F., Mao, H., Fan, J. & Chen, L. Aydınlatma saçılımının neden olduğu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu eserleri. Felsefi işlemler. Seri A, Matematik, fizik ve mühendislik bilimleri 37920200153 (2021).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir