Nanopore Sensing kullanarak CRISPR-Cas dizisi özgüllüğünü gözlemleme

Yirmi yılı aşkın bir süre önce, bilim adamları bugün nanopore olarak bilinen kanal oluşturucu proteinleri kullanarak ilk yapay iyon kanalını yarattılar.1 Bu fenomenin ilk temel gösterimi, DNA’yı sıralamak için düşük maliyetli, hızlı bir yöntem olarak hareket eden, bir lipid membran içine gömülmüş bir protein nanogözeneğinden oluşuyordu.1 Günümüzde nanogözenekler, muhtemelen Oxford Nanopore gibi şirketlerin muazzam başarısından dolayı dizileme ile ilişkilendirilmektedir. Bununla birlikte, nanogözenekler ayrıca ayarlanabilir çaplara ve yüzey özelliklerine sahip inorganik malzemelerden de yapılabilir ve bu da biyoalgılama ve teşhis alanlarında yeni fırsatlar sunar.

DNA dizileme veya algılama için kullanılsın, nanoporlar dirençli darbe algılama prensibine dayanır. Moleküller, elektrik alanlarının neden olduğu kuvvetler kullanılarak iki tuz çözeltisi odası arasındaki nano boyutlu açıklıktan geçirilir. Nanogözenek boyunca bir elektrik alanı uygulandığında, voltaj, DNA gibi elektrik yüklü molekülleri nanogözenek boyunca yönlendirir. Moleküller gözenek boyunca hareket ettikçe, tuz iyonlarını içeren sıvı yer değiştirir. Nanogözenekteki sıvı hacmindeki düşüş, dirençte bir artış ve dolayısıyla akımda bir düşüş ile ilişkilidir. Bu akım düşüşü, analitin yükü, moleküler ağırlığı ve yapısı hakkında bilgi sağlayabilir.2

Nanoporlar ayrıca CRISPR-Cas enzimlerini test etmek için ideal bir platform görevi görebilir. Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) ve CRISPR-Associated (Cas) protein sistemi, belirli bir DNA dizisine bağlanmayı ve ardından bölünmeyi sağlayan, diziye özgü RNA kılavuzlu bir protein ikilisidir. CRISPR-Cas sistemi, son zamanlarda devrim niteliğinde ve yaygın olarak kullanılan bir gen düzenleme aracı olarak ortaya çıkmıştır.3,4. 2019’da Weckman ve arkadaşları, nanoporlarda bağlı dCas9’u gözlemleme yeteneğini göstererek dCas9’un klinik DNA numuneleri için bir teşhis aracı olarak kullanılması için ilham kaynağı oldu. Bununla birlikte, teşhis testlerinde kullanım için, bu yöntemi hassas ve hedefe yönelik hale getirmek için öncelikle tasarladığımız kılavuzların özgüllüğünü kıyaslamamız gerekiyordu. Böylece, bunu test etmek için bir DNA nano yapısı oluşturduk.

Biyoloji alanında araştırma yapan fizikçiler ve mühendisler olarak, yol boyunca sistemlerin sınırlamaları hakkında daha fazla şey öğrendik. Bu alandaki yoğun araştırmalara rağmen, mekanizmanın hala iyi anlaşılmayan yönleri vardır; bu da, spesifik ve verimli kılavuz dizilerin tasarımı için parametre uzayının yeterince ana hatları çizilmediği anlamına gelir. Nanopor verilerimin analizi üzerine kılavuzların kendilerine ait bir akılları olduğunu fark etmeye başladığımda bunu zor yoldan öğrendim. Tümü!

Gen düzenleme için CRISPR-Cas araç setinin kullanılmasıyla ilgili önemli bir sınırlama, hedef dışı etkilerdir. Kılavuzlar diziye özgü olsa da, bazıları diğerlerinden daha seçicidir. İnsan genomu çok büyüktür ve bu nedenle kılavuzların hedeflediği 20 baz çiftli bölge, genomun diğer bölgelerine çok benzer olabilir. Bazı durumlarda, baz çiftlerinden yalnızca biri veya ikisi farklılık gösterir. Bu proje boyunca, sadece kendimize özgüllüğü kontrol etmek için bir kontrol oluşturmadığımızı, aslında belirli kılavuz dizileri tasarlamak için CRISPR-Cas sistemlerini kullanan farklı alanlardaki bilim insanları için güçlü bir yaklaşım yarattığımızı fark ettik.

Şu anda, kılavuzların test edilmesi, hücrelerde veya jel elektroforez tekniklerinde yüksek verimli tarama ile bir şekilde sınırlıdır. Bununla birlikte, CRISPR kılavuz hedef dizilerini ve moleküllerin çoklu okumasına izin veren bir DNA “barkodunu” içerecek şekilde tasarlanabilen DNA nanoyapıları kullanılarak, özgüllüğü gözlemlemenin bir yolu olarak “bir tahlil için bir tahlil” oluşturulabilir. rehberlerden. Nanogözenekteki bu nanoyapılar tarafından üretilen sinyaller benzersizdir ve Şekil 1’de görüldüğü gibi bağlanma hakkında bilgi sağlar.

1. Hedef dizilere dCas9’a özgü bağlanmayı değerlendirmek için DNA nanoyapıları. A) DNA barkod bölgesi ve dCas9 çıkıntısı ile DNA Yapısının şeması. Hem barkodu oluşturan dambıl bölgesi için kullanılan sekanslar (mavi) hem de çıkıntı görevi gören hedef DNA bölgesinin şeması (yeşil) vurgulanmıştır. Ek olarak, dCas9 RNP’de yer alan bileşenler de gösterilmiştir. B) Çözelti içinde karıştırılmış iki farklı DNA nanoyapısına (11111 ve 11001) sahip katı hal nanogözeneği, bu yapıların her ikisi de dCas9 bağlanması ile ve olmadan gösterilmiştir, bu da özgüllüğü ve bağlanma etkinliğini belirleme kabiliyetini vurgular. C) İki prob eklendiğinde nanogözenekteki farklı DNA nanoyapılarının nanogözeneğinden akım izleri.

Bu sistemi kullanarak, rehber RNA’nın uyumsuzluklara ne kadar özgül olabileceğini ve uyumsuzluğun konumu ve kimliğinin etkisine de bakabildik. CRISPR-Cas sistemi son derece güçlü bir araç olsa da sınırlamaları vardır ve belki de en önemlisi, kötü tasarlanmış bir kılavuzun kolayca hazırlanabilmesidir. Nanoyapılarımız, bilim adamlarının kılavuzların davranışını doğrudan incelemesine izin verdiği için, deneyciler daha sonra, tek baz çifti değişikliklerine sahip numuneler arasında ayrım yapacak kadar hassas kılavuzlar geliştirebilirler. Bu, bir gendeki tek bir baz çifti değişikliğinin, antibiyotiklere karşı direnç ve savunmasızlık arasındaki fark olabileceği tanılamada özellikle önemlidir. Teşhisin bir diğer önemli alanı, DNA konsantrasyonu ölçümüdür. Teşhiste, konsantrasyon ölçümleri hastalığın ciddiyetini belirlemek için önemlidir. Bu teknolojiyi kullanarak, bir numunede bulunan DNA konsantrasyonunun göreli bir ölçümünü elde edebileceğimizi de gösterdik.

Üç teknolojinin (nanopor algılama, DNA nanoteknolojisi ve CRISPR/Cas moleküler mühendisliği) kombinasyonlarını kullanarak, kılavuz dizilerinin temel davranışına ilişkin önemli bilgiler sağlayan kılavuzların bağlanma verimliliğini ve özgüllüklerini ölçmek için bir araç geliştirebiliyoruz. Kılavuz-içsel uyumsuzluk toleransı adı verilen şey nedeniyle, özgüllük söz konusu olduğunda protein komplekslerini tahmin etmenin zor olduğunu göstererek, CRISPR kılavuzlarını mevcut birçok uygulamada kullanmadan önce test etmenin gerekliliğini gösteriyoruz!

Referanslar

1 Kasianowicz, JJ, Brandin, E., Branton, D. & Deamer, DW Tek tek polinükleotit moleküllerinin bir membran kanalı kullanılarak karakterizasyonu. Ulusal Bilimler Akademisi Bildiriler Kitabı 9313770-13773 (1996).

2 Wanunu, M. Nanopores: DNA dizilemeye doğru bir yolculuk. Yaşamın fiziği incelemeleri 9125-158 (2012).

3 Doudna, JA & Charpentier, E. CRISPR-Cas9 ile genom mühendisliğinin yeni sınırı. Bilim 346 (2014).

4 Koştu, FA et al. CRISPR-Cas9 sistemini kullanan genom mühendisliği. Doğa Protokolleri 82281-2308, doi:10.1038/nprot.2013.143 (2013).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir