Memeli hücrelerinde tam olarak ayarlanan çoklu protein stokiyometrisi

Hücrelerdeki çok sayıda proteinin bağıl konsantrasyonu, yani stokiyometri, çok bileşenli protein komplekslerinin işlevi, çok faktörlü indüklenmiş hücre akıbeti belirlemesi ve metabolit yolu düzenlemesi için çok önemlidir. Sentez seviyesinde çoklu gen ekspresyon stokiyometrisinin hassas bir şekilde kontrol edilmesi, memeli sentetik biyolojisinin hedeflerinden biri olmuştur.1. Bu yetenek, aşı mühendisliği, kök hücre dönüşümü ve diğer hücre tedavileri için yeni stratejileri beraberinde getirecektir. Ayrıca stokiyometri ile ilgili soruların cevaplanmasına da izin verecektir. Bununla birlikte, memeli hücrelerinde, mevcut transkripsiyonel düzenleyici sistemlerin sınırlı ayarlanabilirliği ve promotörlerin genetik bağlamları barındırmaya duyarlılığı, dinamik ve ince ayarlı ekspresyon stokiyometrisine sahip bir sistemin geliştirilmesini engeller.2,3.

Yakın zamanda yayınlanan makalemizde Doğa İletişimi, memeli hücrelerinde gen ekspresyonunu kesin olarak ayarlanabilir bir şekilde düzenlemek için çalışan virüsten “ödünç alınan” bir araç kutusu sunuyoruz. Araç kutusu, T7 RNA polimerazlarının (RNAP) bir panelinden ve aynı zamanda promotör dizilerinin aynı kökenli kitaplığından oluşur. Promotörler kendilerini konakçı hücrenin genetik bağlamından ve RNAP kaynağından ayırırlar. Daha önce bakterilerde, bu promotörlerin aktivitelerini geniş bir dinamik aralığa eşit şekilde yaymak için ölçtük.4. Sistemi memeli hücrelerine aktarırken, promotörlerin göreli aktivitelerini koruduğunu gördük, bu dikkate değerdi ama şaşırtıcı değildi, çünkü sistem kendi RNAP’ını taşıyordu. Bununla birlikte, memeli hücrelerinde ekspresyon düşüktü çünkü ökaryotik mRNA, 5′ başlıklı olana kadar stabil değildir. Bu nedenle, RNAP’ı virüs türevi bir kapatma enzimiyle birleştirdik ve sistem çalıştı.

Hedef gen ekspresyonu, bir Hill fonksiyonu tarafından güzel bir şekilde tarif edildi ve promotör kuvvetleri, bakterilerdeki değerlerinden doğrudan aktarılabilirdi. Sistemin karmaşıklığı, birden çok viral RNAP türüne yayılma potansiyeline sahiptir, çünkü altı RNAP’nin aynı kökenli promotörlerini ortogonal olarak tanıyabildiğini gösterdik. Yalnızca sistem ayarlanabilir değildi, aynı zamanda RNAP-promotör çiftlerinden biri, en çok kullanılan memeli promotörlerinin bazılarından daha güçlü ifade sağladı.

İki geni kopyalamak için RNAP’ı kullanarak, ifade seviyeleri arasında önemli rekabetçi etkiler bulduk. Şans eseri, böyle yalıtılmış bir transkripsiyonel sistemde, promotörler arasındaki RNAP kaynak rekabetini kendi içinde analiz etmek, ifadeyi modellemek için yeterlidir. Ortak kaynak, yani serbest RNAP tarafından birleştirilmiş iki Hill fonksiyonunun bir biyokimyasal modeli, iki gen ekspresyon profillerine uyması için kullanıldı. İki gen ifade sistemlerinde türetilen parametreler daha sonra, deneysel verilerle uyumlu tahminler oluşturmak için genişletilmiş üç gen ifade modeline beslendi. Bu, sistemimizin daha fazla sayıda genin kesin stokiyometrisini kontrol etme potansiyelini destekler. Gereken tek şey, destekleyicilerden oluşan bir kitaplık, tahmine dayalı bir rasyonel tasarım modeli ve küçük ölçekli deneylerdir.

Uygulamalı bir gösteri olarak, üç bileşenli protein olan HA, NA ve M1’in stokiyometri programlamasıyla CHO hücrelerinde H1N1 virüs benzeri parçacıkların (VLP’ler) üretimini optimize ettik. VLP’ler, gelişmiş immünojenikliği ve güvenliği için güçlü aşılar yapar. Ek olarak, potansiyel ilaç verme vektörleri olabilirler. İdeal bir stokiyometri, VLP’nin montaj verimliliği ve immünojenikliği için kritik öneme sahiptir5. Deneysel sonuçlarımız, üç bileşen geninin tümü için en güçlü promotörleri kullanmanın VLP verimini en üst düzeye çıkarmanın en iyi yolu olmadığını gösterdi. Sistemin hassas stokiyometri programlaması, kaynak israfını önleme ve montaj verimliliğini önemli ölçüde artırma fırsatı sunar. En iyi stokiyometri arayışında, üç genli promotörlerin 21 kombinasyonu denendi. Veriler ve kaynak rekabeti modeliyle, bir ifade stokiyometrisi manzarası elde ettik ve T7 destekleyicilerinin tam kitaplığını içeren genişletilmiş bir veri kümesindeki 54^3 destekleyici kombinasyonundaki VLP verimini tahmin ettik. Deneysel doğrulama yoluyla, bir avuç promotör kombinasyonu, 2 kat VLP verimine yol açan optimize edilmiş stokiyometri ile doğrulandı.

Tek genden çoklu genlere kadar, konak-dikey transkripsiyon araç kutusunun, gen ifadelerinin hassas programlanmasında güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Tahmine dayalı rasyonel tasarımı etkinleştirerek, sistemin ortogonalliği ve modülerliği, tasarla-yap-test et-öğren döngüsünü basitleştirir. Sistemin memeli sentetik biyolojisindeki ve potansiyel olarak diğer ökaryotik sistemlerdeki karmaşık sorunları çözmek için uygulanmasının sadece bir başlangıç ​​olduğuna inanıyoruz.

Referanslar

[1] Taggart JC, Li GW. Protein-Kompleks Bileşenlerinin Üretimi Stokiyometriktir ve Ökaryotlarda Genel Geri Bildirim Düzenlemesinden Yoksundur. Hücre sistemleri 7, 580-589 e584 (2018).

[2] patel YD, et al. Sentetik Destekleyiciler Kullanılarak Memeli Hücrelerinde Çoklu Gen İfade Stokiyometrisinin Kontrolü. ACS Synth Biol 10, 1155-1165 (2021).

[3] Hong CKY, Cohen BA. Genomik ortamlar, çeşitli temel destekleyicilerin faaliyetlerini ölçeklendirir. genom res 32, 85-96 (2022).

[4] Zong Y, et al. Yalıtılmış transkripsiyonel öğeler, genetik devrelerin hassas bir şekilde tasarlanmasını sağlar. Nat Komün 8, 52 (2017).

[5] Pushko P, Pumpens P, Grens E. Küçük, oldukça simetrik olandan 514 büyük karmaşık virüs benzeri parçacık yapısına kadar virüs benzeri parçacık teknolojisinin geliştirilmesi. İnterviroloji 56, 141-165 (2013).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir