Membrana bağlı DNA nanojonksiyonları, yüksek T hücresi reseptörü tetiklemesinde daha yakın APC-T hücre teması sağlar

T-hücresi reseptörünün (TCR) antijen sunan hücreler (APC’ler) üzerindeki antijenik peptit yüklü majör histo-uyumluluk kompleksine (pMHC) bağlanmasının, T hücrelerinde hücre içi sinyal kaskadlarını nasıl başlattığı iyi anlaşılmamıştır. Hücresel temas bölgesinin boyutu, kilit belirleyicilerden biri olarak kabul edilir. TCR-pMHC ligasyonu üzerine, APC’ler ve T hücreleri arasındaki arayüzde yakın temas bölgeleri oluşturmak için çok sayıda yardımcı molekül toplanır. TCR-pMHC kompleksinin küçük boyutu, hücresel teması ~ 13 nm’lik kısa bir zarlar arası mesafede tutar. Temas bölgesinin T hücresi sinyalleşmesi üzerindeki uzamsal etkisi bildirilmiş olsa da, bu stratejiler esas olarak indirgemeci modellere veya protein yapısındaki değişiklikleri içeriyordu. Bu karmaşık biyolojik sürecin nispeten kapsamlı bir haritasını elde etmek zordur. Bu sorunları ele almak için, zara bağlı iskele olarak kolesterol konjuge TDN’leri kullandık ve gerçek bir APC-T hücre etkileşim sisteminde TCR-pMHC boyutu etrafındaki zarlar arası aralığı manipüle etmek için farklı boyutlarda DNA nanoeklemleri (DNJ’ler) oluşturduk. protein modifikasyonunu içermesi gerekir (Şekil 1).

Şekil 1. TCR sinyalini incelemek için yakın temas bölgesinin DNJ tabanlı hassas manipülasyonunun şematik gösterimi

Bu DNJ’ler, üst köşede 17 nt’lik bir çıkıntı ve üç alt köşede kolesterol etiketleri ile DNA kendi kendine montajı tarafından oluşturulan iki zara bağlı tetrahedral DNA nanoyapısı (TDN’ler) arasındaki DNA hibridizasyonu yoluyla oluşturuldu. Zarlar arası mesafeyi tam olarak ayarlamak için, aynı boyuttaki iki tamamlayıcı TDN birleştirilerek DNJ-7, DNJ-13 ve DNJ-37 olarak adlandırılan üç tip DNJ oluşturuldu ve teorik yükseklikleri 9.8, 13.0 olarak hesaplandı. ve sırasıyla 26.4 nm. İlk önce bu üç TDN’nin başarılı bir şekilde inşa edildiğini ve etkili hücre yüzeyi mühendisliği için iyi performans gösterdiğini doğruladık. Değişken açılı toplam iç yansıma floresan mikroskobu (VA-TIRFM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntülemeye dayalı olarak, DNJ-7, DNJ-13 ve DNJ-37 tarafından oluşturulan zarlar arası boşluk, beklenen değerle iyi bir şekilde eşleşti (Şekil 2) ).

Şekil 2. VA-TIRFM görüntüleme ve DNJ-7, DNJ-13 ve DNJ-37’nin aracılık ettiği zarlar arası aralığın TEM görüntülemesi.

Daha sonra, OVA peptit/LPS ile önceden işlenmiş APC’ler ve OT-I T hücrelerinin hücresel etkileşim sistemini kullanarak DNJ’lerin T hücresi aktivasyonu üzerindeki etkisini test ettik. TDN’lerin kritik bir düşük yüzey yoğunluğunda (μm başına ~180 yapı)2), DNJ-37, normal aktivasyon grubuyla karşılaştırıldığında, T hücresi sinyalleşmesi üzerinde bariz inhibisyona neden oldu. Buna karşılık, T hücresi aktivasyonundaki artışa DNJ-7 ve DNJ-13 neden olurken, en iyi performansı DNJ-7 gösterdi. Kararlı ve eşit antijenik ligasyon öncülü altında zarlar arası aralığın T hücresi sinyalleşmesi üzerindeki etkisini daha fazla test etmek için, her gruptaki ligasyonlu TCR kompleksi sayısı üzerinde hassas kontrole sahip yapay bir T hücresi aktivasyon sistemi oluşturduk. DNJ-7 > DNJ-13 > DNJ-37’nin benzer bir T hücresi stimülasyon eğilimi elde edildi, bu da T hücresi aktivasyonu üzerindeki DNJ etkisinin zarlar arası aralığın modüle edilmesi yoluyla empoze edildiğini ortaya çıkardı (Şekil 3).

Şekil 3. DNA nanoeklem aracılı zarlar arası mesafe ile modüle edici T hücresi aktivasyonu

Ayrıca T hücresi reseptör sinyalinin olası moleküler mekanizmasını da inceledik. Deney sonuçlarımız, ZAP70’in bağlanmış TCR kompleksinin sitoplazmik mikro alanında hızla toplanabileceğini ve bu küçük kümelerin kinetik ayrışma modeliyle tutarlı olarak CD45’in zayıf kollokalizasyonunu gösterdiğini gösterdi. TIRFM görüntüleri, CD45’in bağlanan TCR kompleksinin çevresinde dışlandığını ve halka benzeri bir model gösterdiğini doğruladı. CD45 halkasının çapı, DNJ-37’nin dahil edilmesinden sonra yaklaşık üç kat küçüldü ve bu, DNJ-37’nin, T hücresi uyarımı üzerindeki inhibitör etkisi ile iyi bir şekilde anlaşarak, temas bölgesine CD45 difüzyonunu kolaylaştırabildiğini ortaya çıkardı. DNJ-13’ün aracılık ettiği temas bölgesi için CD45 dağılımında ihmal edilebilir bir değişiklik gözlendi. Öte yandan DNJ-7, ~1.5 kat artan halka çapı ile CD45’in katı bir şekilde hariç tutulmasına izin vererek, DNJ-7’nin T hücresi aktivasyonunu teşvik etmedeki üstün performansı için bir açıklama sağladı. İlginç bir şekilde, temas bölgesi içindeki DNJ’lerin doluluğu, DNJ-7 > DNJ-13 > DNJ-37 boyutunda ters bir eğilim sergiledi.

Daha sonra APC’ler ve OT-I T hücreleri arasındaki arayüzü doğrudan görselleştirmek için TEM’i kullandık. DNJ-7’nin aracılık ettiği temas bölgesi, ortadaki eksenel mesafenin ~10.02 nm olduğu ve her iki uçta da teorik boyutu olan ~7.8 nm’ye yaklaştığı iğ şeklinde bir model gösterdi. DNJ-13 için, TCR-pMHC kompleksininkine benzer bir boyuta (~12.8 nm) sahip düzgün zarlar arası boşluklar gözlendi. Bununla birlikte, DNJ-37’nin dahil edilmesiyle, ortadaki zarlar arası boşluk, TCR-pMHC ligasyonu altında ~13.60 nm’de tutulurken, iki uç, halter benzeri bir şekil göstererek 20 nm’den fazla büyütüldü. Bu sonuçlara dayanarak, temas bölgesini eksenel olarak sıkıştırma kapasitesine sahip DNJ-7’nin, TCR kompleksinin konformasyonel değişimini şiddetlendirmek için ek mekanik kuvvetler üretebileceğini tahmin ettik. Bu kuvvet etkisini katı CD45 hariç tutma ile birleştirerek, DNJ-7, T hücresi sinyalleşmesini etkili bir şekilde destekleyebildi. DNJ-13, zarlar arası mesafe üzerinde çok az etki uyandırırken, APC’ler ve T hücreleri arasındaki pMHC ile bağlantılı arayüzü stabilize edebilir, böylece daha güçlü T hücresi uyarımı için uzun süreli ITAM fosforilasyonunu mümkün kılar. Bu bulgular, seri tetikleme modeliyle tutarlı olarak, T hücre sinyalinin yakın temas bölgesinin kararlılığı tarafından da düzenlendiğini kanıtladı. Temas bölgesini antijenik ligasyonu etkilememek koşuluyla gerdirme kabiliyeti ile DNJ-37, TCR sinyalini güçlendirmek için bir çekme kuvveti indükleyebilir, ancak aynı zamanda CD45’in lige edilmiş TCR kompleksine erişimini kolaylaştırabilir, burada ikinci etki bunalır. ilki, T hücresi aktivasyonu üzerindeki inhibitör etkisinden anlaşıldığı üzere.

Özetle, zara bağlı iskele olarak kolesterol konjuge TDN’leri kullanarak, APC’ler ve T hücreleri arasındaki arayüz üzerinde kesin kontrol için farklı boyutlarda DNJ’ler oluşturduk. Bu programlanabilir zara bağlı DNA nanoplatformuna dayanarak, ilk kez gerçek bir APC-T hücre etkileşim sisteminde TCR-pMHC boyutu etrafındaki yakın temas bölgesinin zarlar arası aralığını manipüle ettik. Çalışmamız, yakın temas bölgesinin eksenel boyutunun T hücresi tetiklemesinde önemli bir rol oynadığına dair doğrudan kanıtları destekledi. APC-T hücre arayüzünü kısaltma yeteneği ile, T hücresi bağışıklığı çalışmasına daha geniş bir araştırma penceresinin uygulanabileceğini gösterdik.

benmürekkep: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01333-2

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir