Kromatin bağlamının transkripsiyon faktörü bağlama afiniteleri üzerindeki etkisinin ölçülmesi

Genom boyunca bağlanan transkripsiyon faktörü (TF), çok sayıda biyolojik sürecin düzenlenmesinde yer alır ve genellikle hastalıkta düzensizdir. Bununla birlikte, TF bağlanması, TF bollukları, DNA dizisi ve kromatin bağlamı arasındaki karmaşık etkileşime bağlı olduğundan, TF’lerin potansiyel bağlanma bölgelerinin belirli alt kümelerine ne zaman ve neden bağlandığı iyi anlaşılmamıştır.1,2.

Bağırsak organoid farklılaşması üzerine önceki çalışmalarımızda, farklılaşmayı düzenleyen bazı TF’lerin bağlanmasının, bu TF’lerin artık bilinen ve beklenen bağlanma bölgeleriyle sınırlı olmadığı bir noktaya kadar arttığını bulduk.3. Bunun yerine, motif ve hedef gen aşırı temsil analizlerimizi karıştıran tüm erişilebilir düzenleyici öğelerde bağlanma meydana geldi. Daha sonra ekspresyon analizi, protein bolluğunun bazen hücre başına milyonlarca moleküle ulaştığını ve muhtemelen DNA’daki tüm erişilebilir düzenleyici öğeleri doyurduğunu ortaya çıkardı. Bu sonuç, TF biyolojisini incelerken TF bolluğunu ve epigenetik manzarayı dikkate almanın gerekli olduğunu fark etmemizi sağladı; ancak, yerel kromatin bağlamında bu faktörleri ölçmek için hiçbir araç mevcut değildi.

Son yıllarda, genom boyunca epigenetik manzara ve transkripsiyon faktörü bağlanmasının grafiğini çizmeye olanak tanıyan çeşitli dizilemeye dayalı yöntemler geliştirilmiştir.4,5. Bununla birlikte, bir TF’nin kromatinize DNA’ya bağlandığı konsantrasyonun – bağlanma afinitesinin – belirlenmesi, daha önce genom çapında bir ölçekte mümkün değildi. Bu, epigenom veya TF bolluğundaki değişikliklerin TF bağlanması ve müteakip gen ekspresyon düzenlemesi üzerindeki sonuçlarını tahmin etmek zor olduğundan, epigenetik ve gen ekspresyonu verilerinin yorumlanmasını ve entegrasyonunu zorlaştırır.

Kromatinize DNA’ya TF bağlanma afinitelerini belirlemek için, bir TF’nin genomdaki potansiyel bağlanma bölgelerini bağlayabildiği konsantrasyonu ve bunun nasıl etkilendiğini ölçmemizi sağlayan sekanslama (BANC-seq) yoluyla Yerli Kromatine Bağlanma Afiniteleri geliştirdik. epigenetik manzara. BANC-seq’te izole edilmiş çekirdekler, FLAG etiketli bir TF’nin bir titrasyon serisi ile inkübe edilir. TF konsantrasyonuna bağlı bağlanma daha sonra genom boyunca kromatin immünopresipitasyon ve ardından sekanslama (ChIP-seq) veya hedefler altında bölünme kullanılarak ölçülür ve bağlı DNA’yı sekanslamak için nükleaz (CUT&RUN) kullanılarak salınır. Daha sonra bağlanma afiniteleri, TF konsantrasyonları boyunca bağlanma sinyaline bir Hill denklemi bağlanma eğrisi uydurarak her bir bağlanma bölgesi için hesaplanır (Şekil 1a). TF bağlanması sırasında epigenetik manzara bozulmadan tutulduğundan, saptanan bağlanma afiniteleri hem yerel kromatin içeriğine hem de altta yatan DNA dizisine bağlıdır. Bu nedenle, BANC-seq verileri, kromatin içeriğinin TF bağlanmasını ve afiniteleri nasıl etkilediğini araştırmak ve TF bolluğundaki değişikliklerin genom boyunca TF bağlanmasındaki değişikliklere nasıl yol açtığını tahmin etmek için benzersiz bir şekilde uygundur.

Şekil 1 | BANC-seq deneysel prosedürüne ve yorumuna genel bakış. A. Çekirdekler, FLAG etiketli bir TF konsantrasyon aralığı ile inkübe edilir, ardından ChIP-seq veya CUT&RUN ile spike-in kontrolleri (normalleştirme için) ve mutlak görünür TF bağlanma afinitelerinin hesaplanması (KDUygulamalar) normalize edilmiş dizileme okumalarının bir Hill denklemi bağlanma eğrisine uydurulmasıyla her bir bağlanma bölgesinde. B. TF bağlanma afinitesinin kromatin bağlamı, DNA dizisi ve TF’lerin hedeflerine konsantrasyona bağlı bağlanması ile nasıl düzenlendiğinin gösterimi.

TF’ler YY1, MYC/MAX, SP1 ve FOXA1 için BANC-seq gerçekleştirmek, her bir TF için binlerce nanomolar-afinite bağlanma bölgesini ortaya çıkardı. BANC-seq verilerimizi epigenom verilerimizle entegre ederek, bir bağlanma bölgesinin kromatin içeriğinin, özellikle DNA erişilebilirliğinin nanomolar bağlanma afinitelerinin önemli bir belirleyicisi olduğunu bulduk. Şaşırtıcı bir şekilde, yüksek afiniteli bağlanma bölgeleri çoğunlukla destekleyici bölgelerde bulundu, bu da bu bölgelerin düşük TF ekspresyon seviyelerinde ilk işgal edilenler olduğuna işaret ediyor. Bununla birlikte, FOXA1, muhtemelen yoğunlaştırılmış kromatini doğrudan bağlamasını sağlayan öncü bir TF rolü nedeniyle, önceden var olan erişilebilirlik veya promotör elementlerin varlığı ile daha az kısıtlandığı için bir istisna gibi görünüyordu. Ayrıca, BANC-se

q, DNA dizisi motiflerinin ve izin verici bir kromatin ortamının, TF bağlanmasını kolaylaştırmak için uyum içinde çalıştığını ortaya çıkardı; burada mükemmele yakın konsensüs motifleri, yüksek afiniteli bağlanma için özellikle önemlidir, ancak düşük afiniteli bağlanma için daha az önemlidir (Şekil 1b).

BANC-seq, nicelleştirilecek epigenom, DNA dizisi ve TF bolluğu arasındaki etkileşimi araştırmamızı sağlar. Bu yeni kantitatif veri türü, belirli bir epigenetik durum verildiğinde, TF bağlama bölgelerinin gerekli TF konsantrasyonlarına göre tabakalaşmasını sağlar ve TF bağlama motiflerini ve düzenleyici ağları analiz ederken çıkarımlara sahiptir. Bu analizler artık TF konsantrasyonuna bağlı motifleri ve hedef genleri içerecek şekilde genişletilebilir. Ayrıca BANC-seq, yeniden programlama faktörlerinin veya hastalıkla ilişkili (onko)genlerin aşırı ekspresyonu gibi TF bolluğundaki değişikliklerle karakterize edilen biyolojik olayların yorumlanmasına yardımcı olur.

BANC-seq’in belirli bir statik epigenetik ortamda TF bağlanma potansiyeli hakkında fikir vermesine rağmen, TF bağlanmasının aşağısında yer alabilecek bağlanma afinitelerindeki değişiklikleri ve ardından epigenomun yeniden şekillenmesini değerlendirmediğini not etmek önemlidir. Ek olarak BANC-seq, biyolojik olarak aktif kalırken uygun bir konsantrasyonda saflaştırılabilen etiketli, rekombinant TF’ler gerektirir; bu da zayıf çözünür TF’lerle deneyleri potansiyel olarak karmaşıklaştırır ve test edilebilir konsantrasyon aralığını kısıtlar.

Gelecekteki çabalar, eşleşen epigenom profilleme ile birlikte BANC-seq kullanılarak TF aileleri ve epigenetik durumlar boyunca afinite çözülmüş TF bağlama profillerinin miktarının genişletilmesini içerecektir. BANC-seq’in, TF’lerin epigenom, diğer TF’ler ve kromatin yeniden şekillendiricilerle dinamik olarak nasıl etkileşime girdiğine dair içgörü sağlayacağını ve epigenomun TF’ler tarafından nasıl okunup yazıldığını ortaya çıkarmamıza izin vereceğini umuyoruz.

Referanslar

  1. Guo, J. ve ark. (2014). “Dizi özgüllüğü, Myc’nin genom çapında doluluğunu eksik olarak tanımlar.” Genom Biyolojisi 15(10): 482.
  2. Slattery, M., ve ark. (2014). “Basit bir kodun olmaması: transkripsiyon faktörlerinin genomu nasıl okuduğu.” Trendler Biyokimya Bilimi 39(9): 381-399.
  3. Lindeboom, RG ve ark. (2018). “Bağırsak organoid farklılaşmasının bütünleştirici multi-omik analizi.” Mol Syst Biol 14(6): e8227.
  4. Dunham, I., et al. (2012). “İnsan genomundaki DNA öğelerinin entegre bir ansiklopedisi.” Doğa 489(7414): 57-74.
  5. Lambert, SA ve ark. (2018). “İnsan Transkripsiyon Faktörleri.” Hücre 172(4): 650-665.

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir