Kök hücrelerden fonksiyonel böbrek proksimal tübüllerinin büyütülmesi

Dünya çapında 800 milyondan fazla insanı etkileyen kronik böbrek hastalığı (KBH), dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Yaygınlığına rağmen KBH için tedavi seçenekleri sınırlıdır ve hastalık mekanizmalarının tam olarak anlaşılamaması nedeniyle tedavisi karmaşıktır. Böbrek proksimal tübül (PT) segmentlerinin yaralanmaya karşı savunmasızlığı ve bunun KBH gelişimi için oluşturduğu riskin artması, fonksiyonel PT’nin oluşturulmasını böbrek rejenerasyonunun önemli bir hedefi haline getirmiştir. Yenilenebilir bir olgun fonksiyonel insan PT kaynağı, yalnızca böbrek gelişimi ve hastalığının modellenmesi için değil, aynı zamanda etkilenen hastalarda böbrek fonksiyonunun desteklenmesine yönelik ilaç taraması ve biyomühendislik yaklaşımları için bir platform olarak da paha biçilmez olacaktır.

Bugüne kadar böbrek alanındaki modelleme ve tarama yaklaşımlarının çoğunda İzole edilmiş insan veya kemirgen PT’nin 2 boyutlu kültürleri. Ancak YT olgunluğunu koruma konusunda benzer zorluklarla karşılaştılar. PT’nin karmaşık mekansal organizasyonunun yeterli şekilde özetlenmesinin de benzer şekilde zor olduğu kanıtlanmıştır. in vivo Nefronun geçişli yeniden emilimi, salgılanması ve metabolik aktivitelerine farklı katkılarını yansıtan, erken, orta ve geç PT segmentleri boyunca düzenlenmiş farklı hücre alt tiplerine sahip tübül. Sonuç olarak, pluripotent kök hücrelerden (hPSC’ler) biyomühendislik böbrek dokusunun (böbrek organoitleri) yönlendirilmiş farklılaşma protokollerinin ortaya çıkışı, alana büyük umutlar getirmiş ve hastalık ve toksisitenin modellenmesinden hücre etkileşimlerinin araştırılmasına kadar her şeye böbrek organoidlerini uygulayan çalışmaların çığ gibi artmasına neden olmuştur. . Bununla birlikte, bu tür çalışmaların cesur iddiaları ve umut verici bulguları, böbrek organoid modellerinin insan modelleriyle karşılaştırıldığında büyük ölçüde olgunlaşmamış kaldığı gerçeğiyle gölgelendi. in vivo özellikle PT segmentiyle ilgili olarak benzerleri.

2022’de PT ile geliştirilmiş böbrek organoidlerine ilişkin orijinal raporumuzu destekleyen, insan PT’sinin daha doğru modellerine olan bu ihtiyaçtır. 1 ve bu metodolojinin daha sonra Nature Protokollerinde yayınlanması 2. Bu yeni makale, farklılaşma sonucu için kritik olan PSC tohumlamasının sıklıkla gözden kaçan erken aşamaları da dahil olmak üzere, PT ile geliştirilmiş organoid neslinin tüm yönlerine ilişkin kapsamlı bir fikir vermektedir. Protokolü geliştirirken, nefron oluşumu ile mevcut böbrek organoid modelleri ile karşılaştırıldığında kalıcı metanefrik böbrekte nefrogenezin başlaması arasındaki önemli zamansal farklılıkları göz önünde bulundurduk. in vivo ~7 haftalık gestasyona kadar başlamaz (çoğu organoid protokolde ~1-2 haftalık farklılaşma ile karşılaştırıldığında). Ayrıca metanefrik nefron progenitör spesifikasyonunu yönlendiren büyüme faktörü sinyalindeki kesin olarak zamanlanmış değişiklikleri de göz önünde bulundurduk. in vivo. Sinyalleme ve gradyan oluşumundaki ince değişikliklerin bir ortamda yeniden yaratılması anlaşılır derecede zordur. laboratuvar ortamında ayar, bu muhtemelen hem ata kimliğini hem de ortaya çıkan nefronların desenini etkiler.

Gelişimsel olarak bilgilendirilmiş bu yaklaşım sayesinde, başlangıçta hPSC’den türetilmiş ilkel çizgi ve ara mezodermin (IM) posteriorizasyonunu posterior IM’den türetilmiş metanefrik nefron progenitörlerine doğru daha sağlam bir desene yönlendirerek organoid modelimizde PT spesifikasyonunu ve olgunlaşmasını geliştirdik. Daha sonra bu metanefrik spesifikasyon aşamasını genişleterek, özel kültür ortamlarında (nefron progenitör bakım ortamı, CDBLY2, Tanigawa’dan uyarlanmıştır) uzun süreli kültür yoluyla ve erken gelişmiş nefrojenezin önlenmesi yoluyla kararlı nefron progenitörlerinin zenginleştirilmesini teşvik ettik. ve ark. 3) (Şekil 1). Hesaplanan bu ayarlamalar bir araya getirildiğinde, kamuya açık diğer tüm böbrek farklılaşma veri kümeleriyle karşılaştırıldığında bugüne kadar rapor edilen en olgun PT’ye sahip organoidlerin ortaya çıkmasına neden oldu; S1, S2 ve S3 PT hücre alt tiplerinin ilk kanıtlarını, gelişmiş taşıyıcı işlevselliğini ve uygunluğu gösterdi. PT ile ilgili hastalıkların modellenmesi için 1.

Şekil 1: PT ile geliştirilmiş organoid protokolü ve sonucu. A) FGFG9 değişiminden önce 5 gün boyunca hPSC’lerin CHIR99021’e maruz bırakılması yoluyla oluşan ilkel çizgi ve ara medosderm popülasyonlarının ilk posteriorizasyonunu içeren PT ile geliştirilmiş protokolü gösteren şematik. Nefron progenitör spesifikasyonu aşaması daha sonra CDBLY2’de uzun süreli kültür yoluyla başlatılır; bu, aynı anda progenitörlerin kendiliğinden epitelizasyonunu önlerken devam eden proliferasyonu ve metanefrik spesifikasyonu destekler. B) Parlak alan ve konfokal görüntüleme (canlı konfokal ve immünofloresan) [far right]PT ile geliştirilmiş protokolün önemli aşamaları sırasında tek katmanlı ve organoid farklılaşma morfolojilerinin. Farklılaşan tek katmanlı iPSC’lerin ve 3D organoidlerin görüntüleri protokolün 0 (D0), 13 (D13 ve D13+0), 18 (D13+5) ve 27 (D13+14) günlerinde gösterilmektedir. Hasat gününe ait PT ile güçlendirilmiş organoidlerin örnekleri (D13+14), TRITC-konjuge albüminin (kırmızı) proksimal tübüllere alımını, işlevselliğin göstergesini ve nefron belirteçlerinin (nefron epitelyumu, EPCAM) ifadesini gösterir. [green]proksimal tübül, LTL [blue]glomerüllerin podositleri, NPHS1 [grey]ve Henle döngüsü, SLC12A1 [red]). Ölçek çubukları 200μm’yi temsil eder.

Şaşırtıcı bir şekilde, bu metanefrik atalardan bir mikro kütle oluşturulduktan sonraki 5 ila 8 gün içinde, ortaya çıkan PT ile güçlendirilmiş organoidler, desensiz bir stromal çekirdeği çevreleyen merkezi bir glomerül halkasından dışarı doğru uzanan çarpıcı radyal olarak hizalanmış nefronlar geliştirdi. Potansiyel nedensel sinyalleşme gradyanlarını oluşturmak için ayrıntılı tek hücreli transkripsiyonel profil analizleri ve fonksiyonel analizler, PT ile güçlendirilmiş organoidlerdeki nefron uzaysal düzenlemesinin, kortikal stromanın merkezi çekirdeğinden kaynaklanan lokalize bir WNT antagonizması kaynağından kaynaklandığını belirleyebildik ve ön -kıkırdak hücreleri. Bildiğimiz kadarıyla bu, biyomühendislik ürünü dokularda uzaysal olarak kontrol edilen nefrojenezin ilk gösterimini temsil ediyor.

Doğa Protokolleri’ndeki ayrıntılı metodolojimiz, biyomühendislik ürünü böbrek dokusunun desenini iyileştirmeye ve kontrol etmeye yönelik yeni yaklaşımlar hakkında daha derin bilgiler sağlayarak mevcut organoid protokolleri ve uygulamaları genişletecek bir platform sağlar. Bu tür protokollerin sürekli erişilebilirliğinin, KBH tedavilerini ve sonuçlarını iyileştirmek amacıyla böbrek hastalığı araştırma alanında daha fazla ilerlemeye yol açacağını umuyoruz.

Referanslar

  1. Vanslambrouck JM, Wilson SB, Tan KS, Groenewegen E, Rudraraju R, Neil J, Lawlor KT, Mah S, Scurr M, Howden SE, Subbarao K, Little MH. Fonksiyonel proksimal tübülün geliştirilmiş metanefrik spesifikasyonu, böbrek organoidlerinde toksisite taramasına ve bulaşıcı hastalık modellemesine olanak tanır. Nat İletişim. 2022.8;13(1):5943.
  2. Vanslambrouck JM, Tan KS, Mah S, Küçük MH. İnsan pluripotent kök hücrelerinden proksimal tübül ile güçlendirilmiş böbrek organoitlerinin üretilmesi Nat Protokolü. 2023. (Baskıdan önce Epub).
  3. Tanigawa S, Taguchi A, Sharma N, Perantoni AO, Nishinakamura R. Embriyolardan ve Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Nefron Atalarının Seçici İn Vitro Yayılımı. Hücre Temsilcisi. 2016.26;15(4):801-813.

Katkıda Bulunanlar

Vanslambrouck JM1,2Küçük MH1,2,3

  1. Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi (reNEW), Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü, Parkville, Melbourne, Avustralya.
  2. Pediatri Bölümü, Tıp Fakültesi, Diş Hekimliği ve Sağlık Bilimleri, Melbourne Üniversitesi, Parkville, Melbourne, Avustralya
  3. Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi (reNEW), Sağlık ve Tıp Bilimleri Fakültesi, Kopenhag Üniversitesi, Danimarka

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir