“Kimyasal antikorlar” bulmak artık samanlıkta iğne aramaya benzemiyor

Araştırmacıların 10 aptamer içeren bir kütüphaneden bir aptamer bulmaları gerekiyor.15 adaylar. Bu sayı dünya nüfusunun 100.000 katıdır. Geleneksel olarak milyarlarca hedef molekül kütüphaneyle bir çözelti içinde karıştırılır. Bir dengeye ulaştıktan sonra, hedef moleküllerin ve spesifik aptamerlerin komplekslerinin membran üzerinde yoğunlaşması ve istenmeyen aptamer adaylarının uzaklaştırılması umuduyla çözelti bir membrandan filtrelenir. Maalesef moleküler bağlanma fiziksel bir etkileşimdir. Filtreleme adımı sırasında belirli adaylar hedef moleküllerden ayrılarak membrandan geçebilir ve kaybolabilir. Ayrıca adaylar hedef moleküllerle birlikte membrandan geçebilirler. En önemlisi kütüphane, hedef moleküllerin yanı sıra membrana da bağlanabildiğinden membran üzerinde yoğunlaşabilir. Bu nedenle araştırmacıların bu işlemi tekrarlaması gerekmektedir. Bunu yapmadan önce, membran üzerindeki moleküller güçlendirilerek yeni bir aptamer kütüphanesi oluşturulacak ve bunların birçoğu hedef moleküller yerine membrana bağlanacak. Bu prosedür genel olarak on ila on beş kez tekrarlanacaktır. Ancak amplifikasyon, tüm adaylara eşit muamele etmek yerine bazı adayları amplifiye etme eğiliminde olan polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanmaktadır. Araştırmacılar, tekrarlanan sürelerin artmasıyla bu önyargının giderek daha şiddetli hale gelebileceğini buldu. Sonuç olarak, araştırmacılar kütüphaneden aptamer arama prosedürünü tekrarlayarak çok fazla zaman harcasalar da, sonunda istediklerini elde edemeyebilirler. Bu zaman alıcı prosedüre yoğun işçilik ve garantili başarı olmaksızın yüksek maliyetler eşlik eder. Bu nedenle, aptamer bulma prosedürü sadece yeni başlayanlar için değil aynı zamanda deneyimli araştırmacılar için de samanlıkta iğne bulmak gibi sinir bozucudur.

Aptamer seçimi prosedürünü kolay ve verimli hale getirmek için araştırmacılar, mikro boncuk bazlı seçim, kılcal elektroforez bazlı seçim ve mikroakışkan bazlı seçim gibi birçok zarif yöntem geliştirdiler. Ancak bu yöntemler, özel eğitim almayan birçok araştırmacı için fazlasıyla karmaşık olabilecek araçlara dayanmaktadır. Daha da önemlisi, PCR amplifikasyon yanlılığı, proteinler veya aptamerlerdeki konformasyonel değişiklikler, düşük aptamer çeşitliliği ve özellikle seçim matrisi ve hedef moleküllere spesifik olmayan bağlanma gibi zorluklar hala mevcut olabilir. Bu nedenle aptamer seçimi için farklı bir prensiple, yani üç boyutlu, kirlenmeyen ve makro gözenekli bir alanda birleşik bağlanma-difüzyon prosesi ile yeni bir yöntem oluşturduk. Bu yöntem adı verildi SAHİP OLMAK (yani aptamer seçimi için hidrojel).

İdeal olarak, tanımlanmış bir üç boyutlu geçirgen uzayda yalnızca hedef moleküller ve kütüphane bulunur. Tüm hedef moleküller sihirli bir şekilde hareketsiz hale getirilirken kütüphane ücretsizdir. Böylece kütüphanedeki tüm adaylar, immobilize edilmiş hedef moleküllere yüksek mukavemetle bağlanmadıkları takdirde bu tanımlı alanı serbestçe terk edebilirler. Tersine, eğer hareketsizleştirilmiş moleküller tarafından sıkı bir şekilde yakalanırsa adaylar bu alanda hapsedileceklerdir. Ayrıca arzu edilen bir aptamer adayı, önceden bağlanmış bir hedef molekülden ayrılırsa hareketsizleştirilmiş bir molekülü yeniden bağlayacaktır. Dolayısıyla bu adayın yayılma işlemi sırasında kolay kolay kaybolması mümkün olmayacaktır. Bu ideal durumda aptamer seçimi tekrarlama işlemine gerek kalmadan tek bir adımda gerçekleştirilebilir. Tekrarlanan işlemlerle ilgili tüm endişelerden kaçınılır.

Kirlenmeyen bir malzeme, kütüphanenin minimum düzeyde spesifik olmayan bağlanmasına izin vereceğinden, kirlenmeyen bir molekül olan polietilen glikol (PEG) kullanarak sözde sihirli bir alan yarattık. Veriler, kütüphanenin makro gözenekli PEG hidrojelden çok hızlı bir şekilde yayıldığını göstermektedir. Buna karşılık, PEG hidrojeli hedef moleküllerle işlevselleştirildiğinde kütüphanenin görünür difüzyonu yavaşladı. Tek adımda aptamer zenginleştirme havuzu elde edildi. Bu, geniş bir izoelektrik nokta aralığına sahip negatif, nötr ve pozitif yüklü molekülleri temsil eden beş protein hedefinin tümü için de geçerlidir. Yeni nesil dizilime dayanarak, hedef molekül için en az bir yüksek afiniteli aptamer tanımlamayı başardık.

Gelecekte protein dışı hedeflere karşı aptamer seçimi yapmak için bu yöntemi uygulayacağız veya ayarlayacağız.

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir