Kendi kendine birleşen nanopartikül-enzim kümeleri ile multienzimatik basamaklarda substrat kanalına erişim

Enzimleri yarı iletken kuantum noktaları (QD’ler) ve altın nanoparçacıklar (AuNP’ler) gibi prototipik nanopartiküller etrafında görüntülemeye ve sonraki katalitik aktivitelerini değerlendirmeye yönelik ilk odaklanma, hem bir enzimin yapısını stabilize etme hem de kinetiğini önemli ölçüde geliştirme yeteneği dahil olmak üzere birkaç büyüleyici fenomenin varlığını ortaya çıkardı. birçok durumda aktivite.1-5 Bu özellikler, enzimin NP’lere nasıl bağlandığının yanı sıra NP-enzim arayüzünde bulunan benzersiz arayüz ortamının bir sonucu olarak ortaya çıkar; ikincisi, koloidal NP’lerin çevreleyen matrislerini yapılandırma yeteneğinden kaynaklanır. Çalışmamızda His pandantifini kullanıyoruz.6 NP’lere kendiliğinden birleştirmek için protein monomerlerinin uçlarında ifade edilen motifler aracılığıyla birincil NP ekimiz veya biyokonjugasyon kimyamız olarak metal afinite koordinasyonu.6 Birden fazla pandantif His gösteren multimerik enzimler kullanıldığında6 motifler, proteinlerin NP’leri nanokümelere çapraz bağlayacağı ve bunun sonunda mevcut araştırma çabalarımıza ve bu yayına yol açacağı gözlendi.7

İki enzimi birleştirilmiş katalitik adımlarla bu kendi kendine birleşen nanokümelere birleştirmek, uyumlu aracı veya olasılıksal kanallığa girebileceklerini ortaya çıkardı.7-9 Probabilistik kanallama, enzimler, birinci enzimin ara ürününün, difüzyon yerine bir sonraki enzim tarafından hemen substrat olarak alınma olasılığının yüksek olduğu şekilde yeterince yakın konumlandırıldığında meydana gelir. Moleküler difüzyon hızları tipik olarak enzimin toplu çözeltideki katalitik hızlarından çok daha hızlı olduğundan, bu da birleşik kinetik akışın genel hızını önemli ölçüde artırabilir. Bu nedenle, kanal oluşturma, difüzyonla sınırlı bir multienzimatik reaksiyonda katalitik akışı artırmak için en etkili stratejilerden birini temsil eder. İki enzimin gerçekten de kanallık yapmakla meşgul olduğunun nasıl gösterileceğine dair sürekli tartışmalar olmuştur ve birkaç grup, her yerde bulunan glikoz oksidaz-at turpu peroksidaz bağlı enzim sisteminin kanallığa girmediğine dair ikna edici kanıtlar sağlamıştır.10 Bunu göz önünde bulundurarak, diğer sistemleri değerlendirmeye ve keşfettiğimiz kendiliğinden birleşen NP-enzim sistemlerine kaç tane enzimatik adımın dahil edilebileceğini belirlemeye ve fonksiyonel sınırlamalarını anlamaya çalışarak yola çıktık, böylece bir ilk çalışma tasarımı ilkeleri seti mümkün olabilirdi. aydınlatılsın. Oksidatif glikoliz enzimleri, bazı ek yukarı akış sakarifikasyon adımları ile birlikte, bu çalışma için bir model sistem olarak QD’lerle birlikte kullanılmıştır.11 Bu, 4 ila 10 enzimatik adımı içeren nanokümelenmiş basamaklar oluşturmamızı sağladı, bkz. Şekil 1.

Şekil 1. Kendinden montajlı katalitik NP-enzim kümeleri. (A) Çoklu Onun6multimerik enzimler üzerindeki -termini (mor), NP yüzeylerine koordine olur ve bunları fosfofruktokinaz I (PFK, PDB #1PFK) ve 3 farklı boyutta QD ile birlikte nanoplateletler (NPL’ler) ile gösterildiği gibi fonksiyonel olarak nanokümelere çapraz bağlar. PFK. NPL’ler perspektif için açılı olarak gösterilmiştir. (B) Bu çalışmanın odak noktası olan çoklu enzim basamaklarını oluşturan kendi kendine birleşen QD enzim kümelerini gösteren şematik. QD’ler, hedeflenen bir kaskad oluşturan ve kendi kendine nanokümeler halinde birleşen enzimlerin stokiyometrik oranlarıyla karıştırılır. Lineer nişasta gibi başlangıç ​​substratının eklenmesi daha sonra kümedeki multienzim kademesi tarafından ürüne işlenir ve bu da lokalize ara kanallamayı kullanır. (C) NP-enzim kümeleri oluşturmak ve çok adımlı kanallamaya dahil olmak, genel katalitik akışı, önemli difüzyon sınırlamalarıyla karşılaşan serbestçe yayılan enzimlerinkinden kat kat artırır. Kanallaşma, genel geçici süreyi önemli ölçüde azaltarak kendini gösterir (T) bu reaksiyon için. Gevşek tanımlanmış, T bir başlangıç ​​substratının çok adımlı bir enzimatik reaksiyonda nihai ürüne işlenmesi için geçen süredir.

Bu nanokümelerdeki varlığını doğrulamak için kanallığın farklı mekanik yönlerini hedeflemek üzere tasarlanmış çeşitli klasik deneysel formatlar uygulandı. Seçilen enzimatik basamaklarda artan katalitik akışın, QD veya diğer NP varlığından yoksun kontrol numunelerindeki aynı enzim konsantrasyonunun ~10 ila 100 katından fazlasına kanalize edilmesi (bkz. şekil 2). Ayrıca, nanokümelerdeki kanal oluşturma verimliliğinin, reaksiyon kinetiğinin sayısal simülasyonları kullanılarak göreli enzimatik stokiyometriyi optimize ederek, küresel QD’lerden 2-D düzlemsel nanoplatelet’lere (NPL’ler) geçerek ve NP- enzim montaj işlemi.

Şekil 2. 7 enzimli (7E) glukozda nanoparçacıklar ve katalitik performans ile 3-fosfogliserat (3-PG) kademesi. (A) Ampirik enzim oranlarında (kırmızı) 7E sistemi (glikozdan 3-PG’ye) ile birleştirilmiş 520 QD kümesi için zaman içinde NADH dönüşümünü ölçen temsili ilerleme eğrisi vs. solüsyonda serbest aynı enzim (mavi). 10 uM, serbest enzim tahlilinde dönüştürülen nihai NADH miktarını gösterir. Ardışık iki sayısal simülasyon turundan (pembe – Opt 2) sonra belirlenen QD başına optimize edilmiş (Opt) enzim oranları kullanılarak bir araya getirilen ilerleme eğrileri. Optimizasyon için serbest enzim kontrolleri ampirik numunenin sonuçlarıyla aynı sonuçlara sahipti. 520 QD konsantrasyonu = 2,5 nM. (B) QD = 6,25 nM ve NPL = 1,25 nM ile Opt 2 oranlarında 7E kaskadı kullanılarak 660 QD ve 585 NPL malzemesinden oluşan kümelerin temsili TEM mikrografları. Ortalama küme boyutu, bu belirlemede sayılan QD sayısıyla birlikte mikrografın üzerinde verilmiştir. Ek, tek bir kümenin temsili yüksek çözünürlüklü mikrografı. Bu görüntüleri yorumlarken, değişikliklerin ya TEM ızgaraları üzerindeki birikimde ya da TEM’in yüksek vakumunda gerçekleşmiş olabileceği unutulmamalıdır. Enzimler, TEM görüntülerinde 660 QD’nin bazılarının etrafındaki gölgeli alanlar olarak görülebilir. (C) Belirtilen artan 520 QD konsantrasyonları ile birleştirildiği şekliyle sabit enzim konsantrasyonu (Glk 5.5, PGI 1, PFK 9, FBA 12, TPI 1, GPD 27, PGK 7.5 nM) ile Opt 2 oranlarında 7E sisteminden temsili ilerleme eğrisi tahlil verileri reaksiyonda bulunur. (D) Panel c’deki 0,63, 2,5 ve 25 nM numuneler için karşılık gelen küme analizi çubuğu grafiklerine sahip temsili TEM görüntüleri, eklenen QD ile küme boyutunun arttığını ortaya koyuyor.

Montaj oluşumunu karakterize etmek ve yapı-işlev özelliklerini netleştirmek için kümelerin özellikle TEM görüntülemesini içeren ayrıntılı fizikokimyasal analizler kullanıldı; bunlar, enzime göre daha fazla QD ekleyerek artan nanoküme boyutunun, her bir kümeye daha fazla enzim dahil ederek kanalı daha da geliştirmek için hareket ettiğini gösterdi (bkz. şekil 2). Olumsuz kinetiklere sahip uzatılmış basamaklar için, kanallı aktivite, kritik bir adımda ayrılarak, son ürünü yukarı akış alt basamaktan saflaştırarak ve bunu substrat olarak aşağı akış alt basamaka besleyerek genel multienzim katalitik işleminde korunabilir. Son olarak, kanala erişime yönelik bu yaklaşımın genelleştirilmiş uygulanabilirliği, diğer sert ve yumuşak NP malzemelerini içeren düzeneklere genişletilerek doğrulandı.

Bu tür kendi kendine bir araya gelen biyokatalitik nanokümelerin, minimalist hücresiz sentetik biyolojiyi mümkün kılmaya yönelik birçok potansiyel fayda sunduğuna inanıyoruz. Enzimatik kanallama ile ilişkili diğer birçok özelliğin anlaşılmasına yardımcı olmak için kolayca erişilebilir bir platform sağlamanın yanı sıra, bu yapılar, çevreleyen zarların sınırlandırılmasına ihtiyaç duymadan hücrelerin bazı metabolik işlevlerini özetlediklerinden, kendilerini yapay hücreler için olası bileşenler olarak önermektedir. Yapay olarak da hareket edebilirler de novo doğal olmayan ürünlerin enzim bazlı biyosentezinde kullanım için katalitik yollar veya metabolonlar; bu, hücre bazlı sentetik biyolojide genellikle erişilemeyen bir şeydir.12 Küçük hacimli, yüksek verimli reaksiyonlar için enzim kümelerini kendi kendine bir araya getirme ve daha sonra birçok farklı doğal ve doğal olmayan substrata karşı yeteneklerini tarama yeteneği, bu sistemlerin farmasötik kitaplıkların sentezi için kombinatoryal kimya yaklaşımlarına bağlanmasına izin verecektir.

Referanslar:

  1. Johnson, BJ, Algar, WR, Malanoski, AP, Ancona, MG & Medintz, IL Nanoparçacık arayüzlerinde enzimatik ivmeyi anlamak: yaklaşımlar ve zorluklar. Nanogün 9, 102-132 (2014). doi: 10.1016/j.nantod.2014.02.005
  2. Vranish, JN, Ancona, MG, Walper, SA & Medintz, IL Nanoparçacık düzenekleri ile enzimatik geliştirme vaadinin peşinden gitmek. Langmuir 34, 2901-2925 (2017). doi: 10.1021/acs.langmuir.7b02588
  3. Ellis, GA, Diaz, SA & Medintz, IL Nanopartikül immobilizasyonu ile enzimatik performansın arttırılması: sentetik biyokimya için gelişmiş analitik ve kontrol yeteneği. Curr. görüş. Biyoteknoloji 71, 77-90 (2021). doi: 10.1016/j.copbio.2021.06.021
  4. Vranish, JN, Ancona, MG, Oh, E., Susumu, K. & Medintz, IL Bir enzimi bir nanopartiküle konjuge ederek eşleştirilmiş enzimatik aktivitenin arttırılması. Nano Ölçek 9, 5172-5187 (2017). doi: 10.1039/C7NR00200A
  5. Díaz, SA, Choo, P., Oh, E., Susumu, K., Klein, WP, Walper, SA, Hastman, DA Odom, TW & Medintz, IL Altın nanoparçacık kalıplama, bir amilaz, maltaz, ve glukokinaz multienzim, yüzey eğriliğinden bağımsız olarak substrat kanalı yoluyla kademeli olarak ilerler. ACS Catalysis 11, 627-638 (2020). doi: 10.1021/acscatal.0c03602
  6. Díaz, SA, Breger, JC & Medintz, IL Enzim veya substrat biyokonjuge kuantum noktaları kullanılarak enzimatik proteolizin izlenmesi. Enzimolojide yöntemler 571, 19-54 (2016). doi: 10.1016/bs.mie.2016.01.001
  7. Vranish, JN, Ancona, MG, Oh, E., Susumu, K., Lasarte Aragonés, G., Breger, JC, Walper, SA & Medintz, IL Nanoparçacık yüzeylerde kolokalizasyonla eşleştirilmiş enzimatik aktivitenin arttırılması: yönlendirilmiş kanallama için kinetik kanıt ara ürünlerin. ACS Nano 12, 7911-7926 (2018). doi: 10.1021/acsnano.8b02334
  8. Ellis, GA, Klein, WP, Lasarte-Aragones, G., Thakur, M., Walper, SA & Medintz, IL Yapay multienzim yapı iskeleleri: mevcut ilerlemeye genel bir bakışla in vitro substrat kanallarının takibi. ACS Catalysis 9, 10812-10869 (2019). doi: 10.1021/acscatal.9b02413
  9. Hooe, SL, Breger, JC, Dean, S., Susumu, K., Oh, E., Walper, SA, Ellis, GA & Medintz, IL, Benzaldehit liyaz kinetik iyileştirmeleri, alkol dehidrojenaza potansiyel kanalizasyon ve substrat kapsamı yarı iletken kuantum noktaları üzerinde sabitlendi. ACS Uygulaması Nano Malzemeler 5, 10900-10911 (2022). doi: 10.1.21/acsanm.2c02196
  10. Abdallah, W., Hong, X., Banta, S. & Wheeldon, S. Mikroçevresel etkiler, kademeli biyokatalizde substrat kanalı olarak gizlenebilir. Curr. görüş. Biyoteknoloji. 73, 233-239 (2022). doi: 10.1016/j.copbio.2021.08.014
  11. Breger, JC, Vranish, JN, Oh, E., Stewart, MH, Susumu, K., Lasarte-Aragonés, G., Ellis, GA, Walper, SA, Díaz, SA, Hooe, SL, Klein, WP, Thakur , MG, Ancona, MG, & Medintz, IL Kendini bir araya getiren nanopartikül enzim kümeleri, çok enzimli basamaklarda substrat kanallamasına erişim sağlar, Nat. komün. 14, 1752 (2023). doi: 10.1038/s41467-023-37255-9
  12. Hooe, SL, Ellis, GA & Medintz, IL Enzimatik retrosentez araç kutusunu oluşturmaya yardımcı olacak alternatif tasarım stratejileri. RSC Kimya Biol. 3, 1301-1313 (2022). doi: 10.1039/D2CB00096B

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir