Gen ifadesini modüle etmek için izsiz bir rehber

Arka plan bağlamı: Jennifer Doudna ve meslektaşları tarafından hassas genom düzenlemesi için iki bileşenli Cas9/kılavuz-RNA (gRNA) CRISPR sisteminin geliştirilmesi, bu yüzyılın en büyük buluşlarından biridir ve 2020 Nobel Kimya Ödülü’nü kazanmıştır. Spesifik DNA bölünmesi elde edilebilir in vivo genom hedefine 20 nükleotid (nt) tamamlayıcılıkla tasarlanmış gRNA’ları kullanarak olağanüstü verimlilikle. O zamandan beri Cas9 proteininin aktivitesini değiştirerek sayısız alternatif CRISPR kullanımı geliştirildi. Bu yaklaşımların birçoğu, her iki DNA-kırıcı katalitik merkezin dCas9 olarak adlandırılan enzimatik olarak ölü bir form oluşturacak şekilde mutasyona uğratıldığı bir Cas9 varyantını kullanıyor. Yeni diziye özgü aktiviteler oluşturmak için Cas9’un N veya C terminaline çeşitli başka protein alanları birleştirilebilir. Örneğin, transkripsiyonel baskı alanlarını dCas9’a, genlerin transkripsiyonel başlangıç ​​bölgelerine yakın bölgelere bağlanmayı hedefleyen bir gRNA kütüphanesi ile birleştirerek, gen nakavtının etkilerini test etmek için genom çapında CRISPR inhibisyonu (CRISPRi) taramaları gerçekleştirmek mümkündür. büyüme veya toksinlere karşı direnç gibi çeşitli hücresel fenotiplere bağlıdır. Karşılıklı olarak, CRISPR aktivasyon (CRISPRi-a) ekranları için transkripsiyonel aktivasyon alanını dCas9’a birleştirerek hedef genler aktive edilebilir. Ek olarak, bölgeye özgü baz düzenleme, kromatin değişikliği veya nükleer süreçlerin görselleştirilmesini gerçekleştirmek için proteinler diğer işlevlerle birleştirilebilir.

Cas9’un moleküler aktivitesine ilişkin çalışmalar, Cas9/gRNA komplekslerinin belirli DNA hedeflerini tanıma, bağlama ve sonuçta parçalama yeteneğini düzenleyen bir dizi yapısal değişikliği ve katalitik “kontrol noktalarını” ortaya çıkardı. Nihai olayın çok adımlı doğası, diziye özgü DNA bağlanmasının sonraki çift sarmal bölünmesinden ayrılmasına izin verir. Örneğin, standart 20 nt kılavuzdan (yani <16nt) daha kısa olan kesik bir gRNA (tgRNA) ile birleştirildiğinde Cas9, hedef dizileri bağlayabilir ancak kesemez, çünkü gRNA'nın son 4 nükleotidinin hedefle eşleştirilmesi gerekir. Bu son olayı tetikle. Böylece, bölünme ortadan kaldırılırken yüksek seviyelerde bağlanma spesifikliği korunur.

Geçtiğimiz birkaç yıl boyunca araştırma grubum, Cas9’u kodlayan gen sürücüleri olarak adlandırılan CRISPR tabanlı “aktif genetik” unsurların ve gen kasetinin yerleştirildiği kesin bölgede Cas9/gRNA bölünmesini yönlendirecek bir gRNA’nın geliştirilmesine yardımcı oldu. genetik şifre. Bu tür gen tahrik elemanları, homolojiye yönelik onarım (HDR) yolunun eyleminin ve germ hattındaki homolog kromozomun gen dönüşümünün bir sonucu olarak süper-Mendel tarzında (>%50) nesillere aktarılabilir. Meyve sinekleri gibi böceklerde yüksek verimli gen sürücüleri geliştirilmiştir.Meyve sineği), Anofel sivrisineklerinin yanı sıra tek hücreli maya ve bakteriler (örneğin, ~%99 bulaşma) ve benzer sistemler, memeliler (fareler) dahil diğer türlerde de umut vaat etmektedir.

Cas9 ve kendisini kopyalamak için bir gRNA taşımanın yanı sıra, bir gen tahrikli kaset aynı zamanda kanla beslenen dişi sivrisineklerin orta bağırsaklarında sıtma parazitlerinin bulaşmasını engelleyen tek zincirli antikorların ekspresyonu gibi yararlı aktivitelere sahip “kargo” da içerebilir. Yardımcı gRNA’lar ayrıca, tercih edilen varyantlarla değiştirilmek üzere ilgili hedef genlerin istenmeyen alelik varyantlarının bölünmesini hedeflemek üzere bir gen sürücüsüne dahil edilebilir. Örneğin, insektisitlere direnç kazandıran voltaj kapılı sodyum iyon kanalının varyantları veya sıtma parazitinin bulaşmasına yardımcı olan konakçı sivrisinek faktörlerinin spesifik varyantları (bağırsak proteini FREP1 gibi), bu tür aksesuar gRNA’lar kullanılarak doğal popülasyonlarda aşamalı olarak ortadan kaldırılabilir. Bununla birlikte, birden fazla gRNA’yı konuşlandıran bu tür stratejilerin, birden fazla genomik bölünme olayıyla (yani, gen sürücüsü yerleştirme bölgesinde ve ikincil hedeflerde) sonuçlanabileceği ve bunun da potansiyel olarak istenmeyen sonuçlarla kromozom yeniden düzenlemelerine veya genomik hasara yol açabileceği endişe vericidir. sonuçlar.

Şu anki çalışma: Şimdi, yeni yayınlanan bir çalışmada Ankush Auradkar ve meslektaşları, tam uzunlukta ve kesik gRNA’ların kombinasyonuna dayanan hibrit bir gen tahrik sistemi tasarladılar. Bu tür sürücülerde Cas9’un aktif formu, hem sürücü elemanının kopyalanmasını (tam uzunlukta gRNA kullanarak) hem de ikincil hedefin transkripsiyonunu baskılamak (tgCRISPRi) veya aktive etmek (tgCRISPRa) için tgRNA’lar kullanarak gen ekspresyonunun modülasyonunu sürdürmek için kullanılır. genler herhangi bir genomik hasara neden olmadan Auradkar ve ark. transkripsiyon başlangıç ​​bölgesi (TSS) veya yukarı akışlı TATA kutuları arasındaki bölgeleri hedef alan tgRNA’ların etkili gen yıkımına (>%80 azalma) yol açabileceğini göstermektedir. Bu strateji, TATA kutusu içeren veya içermeyen genler (TATA’sız promotörler) için başarıyla çalışabilir. Ayrıca, bir transkripsiyonel aktivasyon alanının normalde aktif olan Cas9 proteinine (Cas9-VPR) birleştirilmesi, hedef genin aşırı ekspresyonuna veya yanlış ekspresyonuna yol açabilir. Ayrıca, bu yarasız gen düzenleyici yaklaşım, aksi takdirde gerekli olan genlerin (yani, organizmanın canlılığı veya doğurganlığı için işlevi gerekli olan genlerin) uzaktaki cis-etkili düzenleyici elemanlarını (güçlendiriciler veya cis-düzenleyici modüller = CRM’ler olarak adlandırılır) hedefleyecek şekilde genişletilebilir. Bu tür CRM hedefli tgRNA’lar, canlılığı korurken organizmaların sınırlı bölgelerinde hedef gen ekspresyonunu baskılayabilir (Cas9) veya aktive edebilir (Cas9-VPR). Örneğin, HOX segmenti kimlik geninin bir CRM’sini hedefleyen tgRNA’lar Seks Tarağı Azaltıldı (ScrErkek eşleşen kılların oluşumu için özel olarak gerekli olan bu tür kılların sayısının azalmasına yol açar. Benzer şekilde, esansiyel genin CRM’sindeki baskılayıcı bağlanma bölgesini hedef alan tgRNA’lar bıçaklar(ikinci uzunlamasına kanat damarındaki spesifik ifadeyi yönlendiren), aktive edici Cas9-VRP kaynağının varlığında ektopik damarlar oluştururken, azaltılmış baskı nedeniyle Cas9 varlığında bu damarın öne doğru yer değiştirmesine yol açar.

Auradkar ve ark. ayrıca tgRNA’ların ve geleneksel tam uzunlukta gRNA’nın, bir hedef geni (tgRNA) etkili bir şekilde susturmak ve gen sürücüsünün (tam uzunlukta gRNA) kopyalanmasını sürdürmek için eş zamanlı olarak kullanılabileceğini gösterin. Bu gözlem, kopyalamayı azaltan genleri susturarak (yani, hataya eğilimli homolog olmayan uç birleştirme onarımında yer alan genler) veya genlerin ekspresyonunu teşvik ederek belirli sistemlerde gen tahrikli kopyalama verimliliğini artırmak için tgRNA’ların kullanılma olasılığını ortaya çıkarır. tercih edilen HDR onarım yolu (örn. Cas9-VRP kullanılarak). Ek olarak, sıtma parazitleri veya çeşitli virüsler gibi hastalık patojenlerinin bulaşmasını azaltmak için sivrisineklerdeki gen sürücülerine tgRNA’lar da eklenebilir. Sıtma durumunda, bu tür tgRNA’lar ya parazit gelişimi için gerekli olan konakçı sivrisinek genlerinin ekspresyonunu susturabilir ya da parazitleri ortadan kaldırmak için doğuştan gelen bağışıklık genlerinin ekspresyonunu arttırabilir.

Çalışma devam ediyor: Auradkar çalışmasında geliştirilen teknolojinin uygulamaları gen sürücüleri alanının ötesine de uzanıyor. Örneğin, ortak yazar Saluja Kaduwal, benzer bir tgRNA sisteminin, hedef genin ekspresyonunu azaltmak için insan hücrelerine yerleştirilebileceğini gösterdi. Bu uygulamalar, iki katalitik merkezden yalnızca birinin bulunduğu Cas9’un Nickase versiyonlarını kullanarak vücudun somatik hücrelerinde tercih edilen alelik varyantların iz bırakmadan kopyalanması için CRISPR sistemleri geliştiren ortak yazarlar Annabel Guichard ve Ketta Sneider için özellikle heyecan vericidir. enzim mutasyona uğramıştır. Bir gen kasetinin veya tercih edilen alelik kopyalamanın (tam uzunluktaki gRNA) kopyalanması ve potansiyel gen terapisi sonuçlarına (örneğin, bağışıklık modülasyon fonksiyonları) yardımcı olabilecek diğer genlerin (tgRNA’lar) ekspresyonunun değiştirilmesi için çift etkili gRNA’ların kullanımı geniş uygulamalara sahiptir. Bunlar, grubumuzun ve diğer pek çok kişinin tgRNA içeren gen düzenleme sistemlerini kullanarak izleyeceği heyecan verici yeni yönlerdir.

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir