Gen ifadesi ayarlaması artık çok kolay

Gen ifadesi ayarı: nasıl?

Yakın zamanda CRISPR kullanarak endojen gen ifadesini ayarlamak için yeni bir araç seti tanımladık: CasTuner araç seti. CasTuner, katalitik olarak aktif olmayan bir Cas9’a (dCas9) kaynaşmış bir histon-deasetilaz alanını (hHDAC4) veya FKBP12’ye kaynaşmış bir CasRx (Cas13d) sistemini kullanır.F36V degron ve böylece küçük molekül indirgeyici dTAG-13’ün miktarını titre ederek ayarlanabilir. hHDAC4 alanı, histonlardan aktif işaretleri (asetil grupları) kaldırarak transkripsiyonel baskıya yol açarken CasRx, transkripsiyon sonrası bir tarzda bozulmalarına yol açan RNA’ları hedefler ve keser.

Bu sistemlerin, yalnızca gen ifadesini kapatabilen yaygın olarak kullanılan KRAB-dCas9 sisteminin aksine, endojen hedef genlerin homojen ara ifade düzeylerini indükleyebildiğini gösterdik. Bir metafor kullanarak, ifade edilen bir geni bir ampul olarak hayal edersek, CasTuner bir kısma anahtarını temsil ederken, KRAB tabanlı sistemler geçiş anahtarlarıdır. Ek olarak, CasTuner’ı bir analog bastırıcı olarak ve KRAB tabanlı sistemleri dijital bastırıcılar olarak adlandırıyoruz.

CasTuner, orta seviyelerde ifade edildiğinde, yalnızca bir geni kapatabilen KRAB tabanlı olanlar gibi dijital baskılayıcıların aksine, hücreler arasında homojen bir şekilde (analog baskılayıcı) ara hedef gen ekspresyonunu indükler.

Pekala, ama aslında CasTuner’ı nasıl kullanabilirim?

CasTuner sistemleri, PiggyBac transpozisyonu kullanılarak hücrelerde stabil bir şekilde eksprese edilebilir: plazmitlerin bütünleştirici kısmı, PiggyBac tanıma bölgeleri tarafından kuşatılır ve bir PiggyBac Transposase ile birlikte transfeksiyon yoluyla, genoma stabil bir şekilde entegre edilir. Bir antibiyotik seçim işaretçisi, başarılı entegrasyon olaylarının zenginleştirilmesini kolaylaştırır ve baskılayıcı sistemlere doğrudan kaynaşmış mavi flüoresan proteini (tBFP), akış sitometrisi kullanılarak hücrelerin istenen ifade seviyeleriyle sıralanmasına izin verir.

CasTuner ile hücre dizisi oluşturma

Bir hücre çizgisi elde edildikten sonra, bir sonraki adım ilgili geni seçmek ve promotörünü (hHDAC4-dCas9 için) veya kopyalanmış RNA’yı (CasRx için) hedefleyen tek kılavuz RNA’lar tasarlamaktır. Tipik olarak, hücrelerde dönüştürdüğümüz bir lentiviral plazmide dört adede kadar kılavuz dahil ederiz. Transdüksiyondan önce hücreleri 500 nM dTAG-13 ile tedavi ederek, ilgili deney başlamadan önce tüm baskılayıcıyı bozduğumuzdan ve sızdıran baskıdan kaçındığımızdan emin oluruz. Sistemlerimiz indüklenebilirdir ve bu, hem temel genlerin bozulmaları hem de belirli bir zamanlama gerektiren deneyler için önemli olabilir: deneyin başlangıcında, baskılayıcı stabilizasyonuna izin vermek ve sonuç olarak gen baskısını hedeflemek için ligand ortamdan çıkarılabilir. Buna ek olarak, ligandın ortama geri eklenmesiyle pertürbasyonlar tersine çevrilebilir. Fare embriyonik kök hücrelerinde, test ettiğimiz ana sistemler için bir hedef gen için bastırma ve derepresyonun kinetik parametrelerini de ölçtük.

CasTuner ile bir geni indüklenebilir ve tersine çevrilebilir şekilde bastırma

Açıkçası, CasTuner’ın ana amacı ve avantajı, endojen gen ekspresyonunu ayarlamaya izin vermesidir. Ortamda alt doygunluktaki ligand konsantrasyonlarını kullanarak, hedef geni sadece kısmen baskılayan ara CasTuner seviyeleri elde edebiliriz. Tipik bir deneyde, hücreleri CasTuner sistemi ile alır ve kararlı bir şekilde entegre edilmiş kılavuz RNA’ları hedef alır ve bunları, her biri ortam içinde farklı bir dTAG-13 konsantrasyonuna sahip olacak şekilde birden çok hazneye ekeriz. Bu şekilde, her kuyuda, vahşi tip seviyesinden (500nM dTAG-13) elde edilebilecek minimum seviyeye (0nM dTAG-13) kadar farklı bir hedef gen ekspresyonu seviyesine sahip olabiliriz.

Kantitatif pertürbasyonları fizyolojik olarak ilgili aralıklarda gerçekleştirebilmenin neden önemli olduğunu düşünüyoruz?

Tarihsel olarak, gen fonksiyonları, bir genetik değişikliğin etkileri analiz edilerek aydınlatılmıştır. Başka bir deyişle, genler onları incelemek için kırılmıştır – silmeleri veya etkisizleştirici mutasyonları düşünün. Çeşitli nedenlerden dolayı çoğu zaman ilgili genetik sekansa dokunmadan bırakmak ve bunun yerine ürününün ekspresyon seviyesini değiştirmek tercih edilir. Örneğin, CRISPRa ve CRISPRi sistemleri bir geni sırasıyla yukarı veya aşağı regüle edebilir. Bununla birlikte, “doza bağlı süreçler” olarak adlandırdığımız, belirli miktarlarda proteinlere veya RNA’lara dayanan çok sayıda biyolojik süreç vardır. Bu tür süreçler, birkaç isim vermek gerekirse, vücut kalıplarının spesifikasyonunu, embriyonik kök hücrelerin farklı soylara farklılaşmasını, rastgele X kromozomu inaktivasyonunu içerir. Genel olarak konuşursak, hücrelerin durumlarıyla ilgili bilgileri nicel bir şekilde çözdüğünü söyleyebiliriz. Genler, belirli bir anda basitçe AÇIK veya KAPALI duruma getirilmezler, aynı zamanda ifade seviyeleri, miktarları, belirli kimlikler vermek için hassas bir şekilde modüle edilir.

Bazen aynı protein, dozuna bağlı olarak farklı rollere sahip olabilir. Örneğin, pluripotens faktörü OCT4 belirli bir eşiğin altına düştüğünde, fare embriyonik kök hücrelerinin trofektodermal soy içinde farklılaştığı gözlemlenirken, OCT4 aşırı dozu ilkel endoderm soy spesifikasyonunu yönlendirir (Ref. 1). Hem trofektodermin hem de ilkel endodermin embriyo dışı soylar olduğu göz önüne alındığında, bu gözlemler, gen ifadesinin kantitatif modülasyonunun ne kadar önemli olduğunu ve araştırmacıların bunu anlaması için ne kadar gerekli olduğunu ortaya koymalıdır. İronik bir şekilde, gen ekspresyonunu ayarlamak geçmişte oldukça önemsiz olduğundan, hangi süreçlerin doza bağımlı olduğunu ve bu büyüleyici özelliğin altını çizen moleküler mekanizmaların neler olduğunu tahmin etmek zordur. Bu anlamda, bilim camiasıyla paylaşmaktan mutluluk duyduğumuz yeni CasTuner araç setimizin doza bağlı biyolojik süreçlerin daha hızlı keşfedilmesini ve karakterizasyonunu sağlayacağından eminim.

Genetikçiler on yıllardır genleri kırdıktan sonra, şimdi onları ayarlama zamanı.

Açıktır ki, gen ifadesi ayarını gerçekleştirmenin birkaç başka yolu vardır. Örneğin, yakın tarihli bir çalışmada Naqvi ve meslektaşları, doğrudan degron füzyonu yoluyla SOX9 transkripsiyon faktörünün dozajını değiştirdiler (Ref. 2). Protein stabilitesini bu şekilde değiştirmek, CasTuner’da olduğu gibi transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrası seviyeden ziyade doğrudan translasyon sonrası seviyede hareket ettiğinden, protein dönüşü üzerinde daha hızlı bir kontrol avantajına sahiptir. Bununla birlikte, yalnızca zincirleme hücre dizilerinin oluşturulması zaman alıcı olmakla kalmaz, aynı zamanda belirli uygulamaya bağlı olarak başka önemli dezavantajlar da sunabilir. Degron alanları, örneğin, indüklenmemiş durumda bile (bozunma sızıntısı) protein stabilitesinde bir değişikliğe neden olabilir veya indüklendiğinde ilgili proteini tamamen dengesizleştirmeyebilir (düşük bozunma verimliliği). Ancak bu tür yönler, devre dışı bırakma hattı oluşturulmadan önce test edilebilir. Hala kalacak olan en büyük sorun, bir alanın kendi içinde proteine ​​​​füzyonuyla ilgilidir. Çalışmanın amacı, çoklu etkileşimler oluşturan bir protein ise, füzyon alanı bunlara müdahale edebilir. Son yıllarda protein konsantrasyonuna bağlı fenomenlerin (bkz. sıvı-sıvı faz ayrımı/yoğuşma oluşumu) biyolojik süreçlerde yaygın bir rol oynadığı tanımlandığından beri (bkz.Ref. 3), fiziksel-kimyasal özelliklerini araştırmak in vivofizyolojik koşullarda ve protein dizisine eklemeler olmadan, bu alandaki tartışmalı yönlerin açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olabilir.

Referanslar

  1. Niwa, H., Miyazaki, J. & Smith, AG Ekim-3/4’ün kantitatif ifadesi, ES hücrelerinin farklılaşmasını, farklılaşmamasını veya kendini yenilemesini tanımlar. Nat. Genet. 24, 372–376 (2000).

  2. Naqvi, S., Kim, S., Hoskens, H. et al. Transkripsiyon faktörü seviyelerinin kesin modülasyonu, dozaj duyarlılığının altında yatan özellikleri tanımlar. Nat. Genet. 55, 841–851 (2023).
  3. Boeynaems S, Alberti S, Fawzi NL, et al. Protein Faz Ayrımı: Hücre Biyolojisinde Yeni Bir Faz. Trendler Hücre Biyolojisi. 28(6), 420-435 (2018).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir