Floresan biyosensörlerde kromofor karbonil bükülmesi, çok renkli anahtarlama ile protein konformasyonlarının doğrudan okunmasını kodlar

Floresan protein biyosensörleri, hücre biyolojisi, nörobiyoloji, klinik kimya, çevresel izleme ve tarım teknolojilerinde büyük ilerlemelerin kilidini açtı.1. Sınıfının en iyisi flüoresan sensörler, kimyasal olayları sağlam flüoresan sinyallere dönüştürür. Küçük bir molekülün sensöre bağlanması (örn. glikoz veya nörotransmiterler), bir sensörün başka bir proteinle etkileşimi (örn. hücresel sinyal iletim ağları) veya güçlü bir elektrik alanı gibi sensörün fiziksel ortamındaki değişiklikler (örn. elektrokimyasal bir nöron boyunca darbeler) tipik kimyasal olaylardır. Biyosensör gelişimi, kimyasal reaksiyonları (olayları) kurulması zor olabilen bir floresan sinyaline dönüştüren moleküler mekanizmaların derinlemesine anlaşılmasına bağlıdır. Ekteki yazıda2yeni floresan biyosensörlerin geliştirilmesini sağlayacağını tahmin ettiğimiz ince ama güçlü bir floresan sinyal iletim mekanizmasını (Şekil 1) ortaya çıkardık.

Şekil 1. Yapısal olarak hassas bir flüoresan renk değiştirme mekanizması. Tiyol-reaktif Prodan türevleri (sol üstte), sistein kalıntıları aracılığıyla bölgeye özel olarak proteinlere bağlanabilir. Prodan, iki halkanın düzlemine göre bağımsız olarak bükülebilen dimetil amin ve karbonil içeren gruplara sahip iki üyeli bir aromatik halka içerir. X-ışını yapıları, protein konjugatlarında, karbonilin iki veya üç amino asit yan zinciri ile spesifik etkileşimlerle bükülebileceğini ortaya çıkardı. Düzlemsel formda karşılık gelen floresan emisyonu yeşilken, bükülmüş florofor mavi renkte yayar. Bu etkiyi, glikoza yanıt olarak farklı konformasyonları benimseyen glikoz bağlayıcı proteinlerde gösterdik. Apo- ve glikoza bağlı protein konformasyonları, iki renkli bir glikoz sensörü oluşturarak farklı florofor kıvrımlarıyla birleştirilir.

Herhangi bir flüoresan sinyal iletim mekanizmasının kalbinde, enzim kontrolü, ligandın zar boyunca taşınması, motor proteinler gibi çoğu biyolojik sürecin moleküler temelini oluşturduğu için Jacques Monod’un “yaşamın sırrı” olarak adlandırdığı konformasyonel eşleşme olgusu vardır. veya hücresel sinyal iletimi3. Konformasyonel eşleşmede, fiziksel ortamın ligand bağlanması veya pertürbasyonları, protein konformasyon durumlarının dağılımındaki değişikliklerle ilişkilidir. Buna göre, flüoresan biyosensörler, farklı protein konformasyonlarının bir flüoroforun elektronik yapısındaki değişikliklere veya proteine ​​işlenmiş flüorofor çiftlerine bağlanmasıyla oluşturulur.

Birçok flüoresan biyosensör, iki farklı renkte (dalga boyu aralıkları) yayılan iki tasarlanmış flüorofor arasındaki flüoresan rezonans enerji transferindeki (FRET) konformasyona bağlı değişiklikleri kullanır. Uygun şekilde seçilen florofor çiftleri arasındaki mesafedeki bir değişiklik, bunların nispi emisyon yoğunluklarını değiştirir. FRET mesafesi bağımlılığı dik olsa da (floroforlar arası ayrımın altıncı gücü), ilgilenilen protein konformasyonel değişiklikleri küçükse veya protein içindeki küçük bölgelerle sınırlıysa, FRET sensörlerini büyük sinyal değişiklikleriyle tasarlamak zordur. birçok konformasyonel eşleşme olayı için durum. Sonuç olarak, yanıt mekanizmaları doğrudan hassas yerel yapısal değişiklikleri araştıran farklı flüorofor sınıfları, flüoresan biyosensörler oluşturmak için daha genelleştirilebilir araçlar olabilir.

Naftalin bazlı bir florofor ailesi olan Prodan ailesi, 1970’lerin başında Gregorio Weber’in iki üyeli bir aromatik halkanın her iki ucunda bir elektron donör grubunun (amin) bir akseptör (karbonil) ile eşleştirildiğini iddia eden araştırma grubu tarafından geliştirildi. sistem, floroforun elektrostatik ortamına özellikle duyarlı olan bir floresan uyarılmış duruma yol açacaktır.4. Prodan türevlerinin proteinlerdeki belirli bölgelere bağlanması, ligand aracılı konformasyonel değişiklikleri başarılı bir şekilde izleyen floresan biyosensörler ile sonuçlandı. Dikkat çekici bir şekilde, bu tek florofor konjugatları, farklı derecelerde renk kaymalarına rağmen iki farklı renk arasında geçiş yapan sinyaller üretti. Orijinal tasarım hipotezini takiben, bu renk değişiklikleri, protein konformasyonel değişikliklerinin bağlı floroforu çevreleyen çözücü yapısını değiştirdiği ve böylece uyarılmış durumun enerji seviyelerini ve dolayısıyla floresan emisyon renklerini etkileyen elektrik alanlarını etkilediği solvatokromik etkilerden kaynaklandığı şeklinde yorumlandı. . FRET’teki mesafeye bağlı etkiler gibi, solvatokromizm de yerel konformasyonları doğrudan araştırmaz ve yeni biyosensörler oluşturmak için net tasarım ilkeleri sağlamaz.

Bununla birlikte, ekteki makalede ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, Prodan renk değiştirme mekanizmasının aslında florofor karbonil ile az sayıda protein amino asit yan zinciri arasındaki spesifik etkileşimleri içerdiğini keşfettik. Bu lokalize etkileşimler, ligand aracılı yerel protein konformasyonel değişikliklere yanıt olarak değişir. Bu konformasyonel bağlantı mekanizması bu nedenle hassas yapısal değişiklikleri araştırabilir ve genelleştirilebilir bir biyosensör mühendisliği ilkesi için istendiği gibi yapı tabanlı hesaplamalı tasarım yaklaşımlarına uygundur.

Şekil 2. E. coli glikoz bağlayıcı proteinin glikoz aracılı konformasyonel değişiklikleri. Glikoz yokluğunda, protein açık bir yapıyı benimser (solda). Glikozun bağlanması, popülasyonu, glikozun her iki alanın da katkıda bulunduğu yüzeylerle sarıldığı kapalı bir konformasyona kaydırır (sağda).

Spektral analiz araçları, X-ışını kristalografisi ve periplazmik bakteriyel glikoz bağlayıcı proteinlerin (GBP’ler) mutagenezini kullanarak, tiyole reaktif Prodan türevleri Acrylodan ve Badan’ın glikoz bağlanmasına yanıt olarak ağırlıklı olarak mavi ve yeşil renkler arasında geçiş yaptığını gösterdik.2 GBP’ler, bir menteşe ile birbirine bağlanan iki alandan oluşur. Glikoz bu iki alan arasında bağlanır. Bağlanma reaksiyonu, alanlar arası arayüz yüzeylerinin birbirinden ayrı olduğu bir açık, apo-protein konformasyonundan ve bağlı glikozu saran yüzeylerin birbirine yakın olduğu kapalı bir konformasyondan bir konformasyonel değişikliğe neden olur. Farklı konumlarda eklenmiş floroforlar, bir mavi®yeşil veya bir yeşil®mavi renk anahtarını çağrıştırabilir. X-ışını kristalografisi, yeşil rengin düzlemsel olan florofor yapısıyla ve mavi rengin, karbonilin düzlemin dışında ~30° büküldüğü bir yapısıyla ilişkili olduğunu ortaya çıkardı. Her iki durumda da karbonil, iki alan arasındaki bir kanaldaki naftalin halkasının kavranmasıyla ve karbonil, iki veya üç amino asit yan zinciri ile spesifik etkileşimler yoluyla yerinde tutuldu. Bu etkileşimler, protein ve florofor arasındaki etkileşimlerin sterik ayrıntılarına bağlı olarak her iki yönde de renk geçişine olanak tanıyan florofor bağlantı konumlarına özgüdür. Dolayısıyla bu mekanizma, yerel protein konformasyonel yapısını doğrudan araştırır ve florofor konformasyonları ile protein kalıntıları arasındaki etkileşimleri hesaplayarak yapı bazlı flüoresan biyosensör tasarım stratejilerine uygundur.

Mutagenez çalışmaları başka bir incelik ortaya çıkardı: apo-proteinler ve glikoz kompleksleri, saf mavi ve yeşil formlar arasında bir dizi rengi benimseyebilirler. Bu fenomen, konjuge floroforların, belirli bir protein konformasyonunda düzlemsel ve bükülmüş konformasyonların bir karışımını benimseyebileceğini ortaya koydu. Saf renkler, tek üyeli düzlemsel veya bükülmüş florofor topluluklarında oluşturulur; her iki konformasyonun karışımlarını içeren topluluklar, ara renklere yol açar. Her dağılım, bükülebilir karbonil ve protein amino asit yan zincirleri arasındaki ayrıntılı etkileşimlerle belirlenir. Bu mekanizma, flüoresan sensör sinyali optimizasyonuna rehberlik eder: bir protein konformasyonunda flüorofor bükülmesini saptıran mutasyonlar getirir.

Diyabet yönetimi için sürekli izleme sistemleri oluşturmak için kullanılmış olan flüoresan glikoz sensör proteinlerinde bu konformasyonel bağlantı mekanizmasını ortaya çıkardık. Aynı prensipler, çok çeşitli flüoresan biyosensörler oluşturmak için diğer proteinlere genişletilebilir.

Referanslar

1. Demchenko, AP Floresan Algılamaya Giriş. Üçüncü baskı, (Springer, 2020).

2. Allert, MJ, Kumar, S., Wang, Y., Beese, LS & Hellinga, HW Floresan biyosensörlerde kromofor karbonil bükülmesi, çok renkli anahtarlama ile protein konformasyonlarının doğrudan okunmasını kodlar. Doğa İletişim Kimyası 168 (2023).

3. Phillips, R. Moleküler Anahtar – Sinyalizasyon ve Allostery. (Princeton University Press, 2020).

4. Valeur, B. ve Leray, I. Katyon tanıma için floresan moleküler sensörlerin tasarım ilkeleri. Koordinasyon Kimyası İncelemeleri 2053-40 (2000).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir