CRISPR içermeyen, iplikçik seçici DNA baz düzenlemesi, nickazı tanıtarak

Mitokondri, hücrenin “güç merkezi” olarak önemli bir rol oynar ve memeli hücrelerinde çekirdek dışında genetik bilgiyi depolayan tek organeldir. Mitokondriyal genomdaki mutasyonlar genellikle Leber kalıtsal optik nöropati (LHON) gibi ciddi hastalıklara neden olur.1. 93’ü nokta mutasyonlarından (MITOMAP) kaynaklanan 97 doğrulanmış mitokondriyal genetik hastalık vardır. Mitokondrideki elektron transferi, mitokondriyal matrisin dışına proton pompaladığından, matris, aynı negatif yüke sahip nükleik asitlerin girişini engelleyen güçlü bir negatif yüke sahiptir.2. Fonksiyonel bileşenleri protein olan ZFN ve TALEN, mitokondriye girerek mitokondriyal lokalizasyon sinyallerinin rehberliğinde gen düzenlemesi yapabilirler. 2018’de iki grup, fare mitokondrisindeki mutasyona uğramış genomu yok etmek için ZFN ve TALEN kullandı.3,4. Bununla birlikte, demonte, homozigot mitokondriyal mutasyonları tedavi edemez ve mitokondriyal genomun tabanını değiştiremez.

Temel düzenleyiciler ve türevleri, genetik hastalıkların tedavisinde büyük potansiyel göstermiştir. Temel düzenleme, CRISPR-Cas sistemi temel alınarak geliştirilmiştir, çünkü temel düzenleyicilerde kullanılan deaminazlar ssDNA deaminazlardır. Cas9 proteini ve sgRNA’nın yardımıyla, hedef DNA çift sarmalının bir ipliği açığa çıkar ve deaminaz için bir substrat olarak kullanılarak etkili baz dönüşümü sağlar5. CRISPR-Cas sisteminin aksine Çinko Parmak (ZF) ve Transkripsiyon Aktivatör Benzeri Efektör (TALE) yalnızca DNA çift sarmallarına bağlanma etkinliğine sahiptir, ancak DNA çift sarmalını çözmez6,7. Bu nedenle, CRISPR’nin yaygın olarak benimsenmesinden önce, ssDNA deaminazlarının ZF veya TALE ile kombinasyonu, DNA’nın etkili baz düzenlemesini sağlayamıyordu.8.

2020’de Joseph D. Mougous’un ve David R. Liu’nun laboratuvarı, çift sarmallı DNA üzerinde hareket edebilen bir deaminaz olan DddA’yı keşfetti, oysa daha önce bilinen DNA deaminazlarının çoğu yalnızca tek sarmallı DNA üzerinde hareket ediyor. DddA’ya dayanarak yeni bir temel düzenleyici geliştirdiler ve bunu mitokondriyal genomu düzenlemek için uyguladılar.9. Ayrıca Kim Jin-soo’nun laboratuvarı, DddA ve TadA8e kullanarak mitokondriyal genom düzenlemesini de gerçekleştirdi.10. Son zamanlarda, DddA’ya dayalı birçok temel editör ve homologları ve varyantları geliştirilmiştir.11,12. Deaminasyon reaksiyonu, bazın deaminazın aktif cebine dönmesini gerektirdiğinden, bu işlem DNA’nın baz eşleşmesini bozar. Bu nedenle, DddA’nın DNA çift sarmalını çözme ve açığa çıkan bazları deamine etme yeteneğine sahip olabileceğini düşünüyoruz. DddA, iki DNA dizisi arasında ayrım yapmadığından, DddA’ya dayalı temel düzenleyiciler, yalnızca bir DNA dizisi üzerinde hareket eden CRISPR tabanlı temel düzenleyicilerden farklı olarak, DNA’nın her iki sarmalını da düzenler. Ek olarak, DddA ayrıca çekirdekte CTCF ile etkileşime girer, bu nedenle çekirdekte hedef dışı düzenleme meydana gelebilir.13.

DddA yalnızca C’den T’ye baz düzenlemesi yapabilir ve iki DNA zinciri arasında ayrım yapmaz. Bu nedenle, 2021’de mitokondriyal DNA üzerinde A’dan G’ye bazı düzenleme girişiminde bulunmaya başladık. Çok kısa sgRNA’ya sahip Cas12 tabanlı bir temel düzenleyici kullanmak, adenin deamine etmesini sağlamak için DddA’yı mutasyona uğratmak, yetenekli hale getirmek için TadA proteini tasarlamak gibi çeşitli yöntemler denedik. çift ​​sarmallı DNA üzerinde hareket etme, diğerlerinin yanı sıra A’dan G’ye yetenekli DddA homolog proteinleri arama. Ne yazık ki, bu girişimlerin hiçbiri olumlu sonuç vermedi. Şu anda geliştirilen A’dan G’ye deaminaz substratlarının tümü tek sarmallı DNA olduğundan, DNA üzerinde bir çentik oluşumunun, ssDNA deaminaz için bir substrat görevi görebilecek geçici ssDNA oluşturabileceğini tahmin ettik, bu nedenle bir nickaz kullanmaya odaklandık. .

Şekil 1 | CRISPR içermeyen, iplikçik seçici DNA baz düzenlemesi, nikaz tanıtılarak. a,b, MT-RNR2 sitesinde eşleştirilmiş TALE-TadA8e(V106W) (a) ve Left-TALE-MutH ve Right-TALE-TadA8e(V106W) (b) ile işlenen Mitokondriyal A-to-G düzenleme verimliliği. c, mitoBE’ler için spekülatif bir çalışma modeli. TALE-nickase, dsDNA’yı bağlar ve çentikler. Çentikli dsDNA, TALE-deaminazın deaminasyonuna izin veren ssDNA’yı oluşturmaya eğilimlidir. DNA onarımı ve replikasyonunun ardından, çentikli olmayan sarmal üzerindeki düzenleme sonuçları korunur. Bu modelde mitoABE’ler için TadA8e(V106W) kullanılmıştır. Bu model aynı zamanda mitoCBE’ler için de geçerlidir.

TALE-Nickase ve TALE-Deaminase’i mitokondriyal genomu hedef alacak şekilde tasarladık ve bu kombinasyon kullanılarak etkili mitokondriyal DNA baz düzenlemesinin elde edilebileceğini bulduk. İlk olarak, MutH nickazını test ettik. Mitokondriyal genomdaki üç bölgeyi hedeflemek için mitokondriyal lokalizasyon sinyalleriyle birlikte TALE-MutH ve TALE-TadA8e(V106W) kullandık ve tüm test bölgelerinde etkili A-to-G düzenlemesi bulduk. Bu sisteme mitokondriyal DNA baz düzenleyicisi (mitoBE) adını verdik. Daha fazla araştırma, TALE-MutH ve TALE-TadA8e(V106W) tarafından indüklenen düzenlemenin sarmal seçici olduğunu ve düzenleme sonuçlarının TALE-MutH tarafından bölünmeyen DNA sarmalında tutulma eğiliminde olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 1). TALE-MutH’nin bölünmüş sarmalı kontrol edilerek, DNA çift sarmalında düzenlenecek sarmal kontrol edilebilir, bu da mitoBE’nin düzenleme sonuçlarını DddA tabanlı temel düzenleyiciye kıyasla daha spesifik hale getirir.

MutH’nin kendi dizi tercihi vardır ve 5′-GATC-3′ palindrom dizilerinden birini ayırır. MitoBE’nin düzenleme kapsamını genişletmek için yapısal bilgilere dayalı olarak MutH’yi mutasyona uğrattık ve düzenleme aralığını 5′-GATN-3′ olarak genişlettik. Bu mutanta MutH* adını verdik. MutH ile karşılaştırıldığında, MutH* bölünme bölgeleri mitokondriyal genomda her 40 bp’de iki kez meydana gelir ve bu da mitoBE’nin düzenlenebilir aralığını büyük ölçüde genişletir. Ek olarak, tarama yoluyla, Nt.BspD6I ve FokI-FokI(D450A)’nın C-terminalinin, mitoBE sistemine uygulanabilen, tanıma dizisinden bağımsız nickazlar olduğunu bulduk (Şekil 2).

Şekil 2 | MitoBE’ler için tanıma dizisi kısıtlaması olmadan nickazların taranması. Sekans kısıtlaması olmayan veya kapsamlı tanıma sekansları olan nickazlar, üç bölgede mitokondriyal baz düzenlemesi için tarandı. n = 3 biyolojik olarak bağımsız kopyadan elde edilen ortalama değerler gösterilmektedir.

SsDNA deaminazları, CRISPR tabanlı temel düzenleyicilerde yaygın olarak kullanılmaktadır ve mitoBE’ler, neredeyse tüm ssDNA deaminazların dahil edilebileceği bir araç kutusu görevi görmektedir. Örneğin, TALE-MutH ve TALE-rAPOBEC1-2xUGI’nin hedef sitelerde C’den T’ye temel dönüşümü verimli bir şekilde sağlayabildiğini bulduk. DdCBE ile karşılaştırıldığında, mitoBE son derece yüksek zincir özgüllüğüne sahiptir (Şekil 3). Ayrıca, tam genom dizilimi yoluyla, mitoBE’nin hem mitokondride hem de çekirdekte minimum hedef dışı düzenlemeye neden olduğunu ve bunun yüksek özgüllüğünü gösterdiğini bulduk.

Şekil 3 | MitoCBE’lerin ve DdCBE’lerin düzenleme profillerini şu adreste karşılaştırın: MT-ND4 (Sol), MT-RNR2 site 3 (Orta) ve MT-RNR2 site 1 (Sağ). Veriler, n = 3 bağımsız biyolojik kopyanın ortalama değerleri ± sd olarak sunulur.

LHON, mitokondriyal gen mutasyonlarının neden olduğu bir hastalıktır ve bu hastalıkta hatalı DNA bazını düzeltmek için mitoBE kullanmayı denedik. İlk olarak, verimli mitokondriyal DNA sarmal seçici baz düzenlemesi elde etmek için dairesel RNA kodlu mitoBE kullanımını test ettik ve bulduk. Daha sonra hastalardan türetilmiş hücreler kullandık ve dairesel RNA kodlu mitoBE’nin hedef bölgedeki düzenleme etkinliğinin ~% 20 olduğunu ve düzeltilmiş hücrelerin daha yüksek ATP içeriğine sahip olduğunu bulduk, bu da mitoBE’nin mitokondriyal genetik hastalıkları tedavi etme potansiyelini gösteriyor (Şek. 4).

Şekil 4 | Dairesel RNA kodlu mitoABE’ler, LHON hasta kaynaklı hastalık hücrelerindeki mutasyonu başarıyla düzeltti. AcircRNA kodlu mitoABE’ye genel bakışNt.BspD6I(C) transfekte edilmiş LHON hastalığı hücreleri GM10742 ve genomik DNA, transfeksiyondan 3 gün sonra toplandı. b, mitoABE’nin düzenleme verimliliğiNt.BspD6I(C) LHON hastalık hücresi GM10742’nin 11778G>A mutasyonunu düzeltti. c, circRNA kodlu mitoABE ile transfekte edilmiş hücrelerin ATP seviyeleriNt.BspD6I(C) LHON hastalık hücresi GM10742’nin 11778G>A mutasyonunu hedefledi. Student T-testi, p değeri = 6.98E-05. d, circRNA kodlu mitoABE ile tedavi edilen LHON hastalığı hücre dizisi GM10742’nin OCR’siNt.BspD6I(C) 2 gün boyunca 11778G>A mutasyonunu hedefledi. e. Mitokondriyal hastalık türleri (MITOMAP) ve mitoBE’ler tarafından teorik olarak tedavi edilebilen hastalıkların oranı. b için, n = 3 biyolojik olarak bağımsız kopyadan elde edilen ortalama değerler gösterilmektedir. c ve d için veriler, n = 3 bağımsız biyolojik kopyanın ortalama değerleri ± sd olarak sunulur.

Geçici ssDNA deaminaz substratları oluşturmak için nickaz kullanmak, DNA’yı düzenlemek için etkili bir stratejidir. Teorik olarak mitoBE, 97 mitokondriyal hastalık mutasyonundan 84’ünü düzeltebilir ve bu hastalıkların tedavisi için umut verici yeni bir yöntem sağlar (Şekil 4). Dahası, yaklaşımımız çekirdek genomunda da çalışır. Hastalıkları tedavi etmek için mitokondriyal ve nükleer genomdaki hataları düzeltmek için mitoBE uygulaması büyük bir potansiyel göstermektedir.

Bağlantı: https://www.nature.com/articles/s41587-023-01791-y

Referans:

1 Vafai, SB & Mootha, VK Eski bir organele açılan pencereler olarak mitokondriyal bozukluklar. Doğa 491374-383, doi:10.1038/nature11707 (2012).

2 Gammage, PA, Moraes, CT & Minczuk, M. Mitokondriyal Genom Mühendisliği: Devrim, CRISPR-İzlenmemiş Olabilir. Trendler 34101-110, doi:10.1016/j.tig.2017.11.001 (2018).

3 Bacman, SR et al. MitoTALEN, mutant mtDNA yükünü azaltır ve heteroplazmik mtDNA mutasyonunun bir fare modelinde tRNA(Ala) seviyelerini eski haline getirir. Nat Med 241696-1700, doi:10.1038/s41591-018-0166-8 (2018).

4 Oyun, PA et al. Mitokondride genom düzenleme, in vivo olarak patojenik bir mtDNA mutasyonunu düzeltir Nat Med 241691-1695, doi:10.1038/s41591-018-0165-9 (2018).

5 Anzalone, AV, Koblan, LW & Liu, DR CRISPR-Cas nükleazları, temel düzenleyiciler, transpozazlar ve birincil düzenleyicilerle genom düzenleme. Nat Biyoteknoloji 38824-844, doi:10.1038/s41587-020-0561-9 (2020).

6 Deng, D. et al. TAL efektörleri tarafından DNA’nın diziye özgü tanınması için yapısal temel. Bilim 335720-723, doi:10.1126/science.1215670 (2012).

7 Mak, AN, Bradley, P., Cernadas, RA, Bogdanove, AJ & Stoddard, BL DNA hedefine bağlı TAL efektör PthXo1’in kristal yapısı. Bilim 335716-719, doi:10.1126/science.1216211 (2012).

8 Yang, L. et al. Genom düzenleme için deaminaz füzyonlarının mühendisliği ve optimizasyonu. Nat Komün 713330, doi:10.1038/ncomms13330 (2016).

9 Mok, TARAFINDAN et al. Bakteriyel bir sitidin deaminaz toksini, CRISPR içermeyen mitokondriyal baz düzenlemesine olanak tanır. Doğa 583631-637, doi:10.1038/s41586-020-2477-4 (2020).

10 Ço, SI et al. Programlanabilir deaminazlarla insan mitokondriyal DNA’sında hedeflenen A’dan G’ye temel düzenleme. Hücre 1851764-1776 e1712, doi:10.1016/j.cell.2022.03.039 (2022).

11 Mil, L. et al. DddA homolog arama ve mühendislik, mitokondriyal temel düzenlemenin dizi uyumluluğunu genişletir. Nat Komün 14874, doi:10.1038/s41467-023-36600-2 (2023).

12 Mok, TARAFINDAN et al. Mitokondriyal ve nükleer DNA’da gelişmiş aktiviteye ve genişletilmiş hedefleme kapsamına sahip CRISPR içermeyen temel düzenleyiciler. Nat Biyoteknoloji 401378-1387, doi:10.1038/s41587-022-01256-8 (2022).

13 Lei, Z. et al. Mitokondriyal baz editörü, önemli nükleer hedef dışı mutasyonları indükler. Doğa 606804-811, doi:10.1038/s41586-022-04836-5 (2022).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir