Büyük ölçekli bir taramayla tanımlanan verimli TnpB genom düzenleyicileri

CRISPR-Cas teknolojisi, biyomedikal araştırmalarda devrim yarattı. CRISPR-Cas sistemlerinin evrimsel sınıflandırması, yeni alt türlerin açıklanması ve gen düzenlemesi için kullanılmasıyla sürekli olarak güncellenmektedir. Son yıllarda, SaCas9 (1053 aa) gibi daha kompakt boyutlara sahip birkaç CRISPR-Cas alt türü tanımlanmıştır.1Nme2Cas9(1082 aa)2CjCas9 (984 aa)3, boyutları hala 1000 aa’ya yakınken ve düzenleyici alan, temel düzenleyici veya ana düzenleyicinin birleşimi genellikle AAV vektörünün boyut sınırlamasını aşıyor. En son, çok daha küçük bir alt tip, Cas12f sistemleri (410-550 aa)4-7, tespit edilmiştir. Ancak düzenleme sıklıkları, kapsamlı optimizasyondan sonra bile ortalama olarak %10’un altında kalıyor. Bu nedenle, yüksek verimliliğe sahip yeni minyatür gen editörleri oldukça arzu edilir.

Farklı bir kayda göre, CRISPR-Cas’ın evrimsel kökeni de araştırıldı. 2015 yılında Eugene V. Koonin, IS200 / IS605 prokaryotik transpozon ailesinden türetilen IscB ve TnpB’nin sırasıyla Cas9 ve Cas12’nin muhtemelen ataları olduğunu öne sürdü.8. Bu fikre dayanarak, Zhang ve Siksnys grupları, her ikisi de bir RNA kılavuzlu DNA endonükleaz olarak çalışan IscB ve TnpB’nin işlevini, CRISPR-Cas sistemininkine benzer bir şekilde açıkladılar.9, 10. Hem IscB hem de TnpB proteinleri olağanüstü kompakttır (350~550 amniyo asit uzunluğunda). IscB ile karşılaştırıldığında, TnpB, bakteri ve arke genomlarında bir milyondan fazla varsayılan lokus ile çok daha yaygındır. Bu nedenle, TnpB muazzam bir minyatür genom düzenleyicileri kaynağını temsil eder. Bununla birlikte, TnpB sistemlerinin işlevsel ve evrimsel özellikleri büyük ölçüde bilinmemektedir ve büyük ölçeklidir. Silico’da analiz ve deneysel tarama stratejisi geliştirilmeyi beklemektedir.

Şekil 1 | TnpB proteinlerinin TAM ve reRNA dizisinin analizi. A, Transpozisyonda TnpB’nin önerilen rolü. Karvelis ve diğerlerinden uyarlanan panel a [10]. B, IS605 transpozonunun şeması. TnpB editörlerinin potansiyel TAM ve reRNA dizisinin genomik konumu etiketlenir.

Siksnys tarafından önerilen “Soy, Yapıştır ve Kopyala” modelinden esinlenilmiştir. et al.10, hem TAM dizisinin hem de reRNA omurgasının, her bir TnpB lokusunun genomik bağlamından doğrudan alınabileceğini varsaydık (Şekil 1a). Ekleme dizilerinin en kapsamlı veritabanı olan ISfinder’da açıklamalı 64 adayı test ettik. Sonuçlar, her bir TnpB’nin tercih edilen TAM dizisinin genellikle sol ucun üst kısmındaki bölünme dizisiyle aynı olduğunu gösterdi (CL, 4-5 nt) her IS200/IS605 ve reRNA omurgasının 3′ terminali, IS200/IS605 lokuslarının sağ ucuyla (RE) tam olarak eşleşir (Şekil 1b). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar toplu olarak, TAM ve reRNA omurgasının genomik diziden tam olarak alınabileceğini gösterir.

İncir. 2 | TnpB ile ilişkili reRNA’nın karakterizasyonu. A, Vekil muhabiri gösteren bir şematik. B, farklı pozisyonlarda sona eren 5′ dizili reRNA yapı iskelesi; C, farklı 3′-uç sekans içeriklerini barındıran reRNA yapı iskelesi; D, farklı uzunluklarda kılavuz segmenti; e, sıralı bir veya iki nt uyumsuzluğu olan kılavuz segmenti. Gen düzenleme verimliliği, raportör tahlili yoluyla ölçüldü, veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD’si olarak gösterildi.

Daha sonra, vekil flüoresan raportör kullanarak TnpB proteinleri için reRNA işlevi için önemli faktörleri karakterize ettik ve şunları bulduk: İlk olarak, TnpB sistemleri, düzenleme aktivitesini destekleyen 120-300 nt yapı iskeleleri ile çeşitli reRNA yapı iskelesi boyutlarını tolere edebilir. İkincisi, reRNA’nın 3′ terminali, RE’nin 3′ ucuyla tam olarak eşleşmelidir, 3′ ucuna tek bir bazın eklenmesi veya çıkarılması, aktiviteyi önemli ölçüde azaltır. üçüncüsü, TnpB 16-20 nt hedef uzunluğunu tercih etti. Son olarak, reRNA kılavuzlarının minimum tohum bölgesi, TAM’a bitişik 12nt’yi içeriyordu (Şekil 2). Toplam olarak, yukarıdaki karakterizasyon, TnpB sisteminde verimli bir reRNA tasarlamak için anahtar parametreleri tanımlar.

Şek. 3 | Aktif TnpB sistemlerinin fonksiyonel özellikleri. A, Aktif TnpB sistemlerinin ikili karşılaştırması, benzer (<%30 sapma) TnpB proteinlerinin aynı optimal TAM dizilerini paylaştığını gösterdi. X ekseni, ikili protein dizisi sapmalarını gösterirken, Y ekseni, karşılık gelen TAM çiftinin (motifler) mesafesini gösterir. olmak, TnpB aracılı genom düzenleme aktivitesinin varlığı/yokluğu arasındaki ilişki E. coli. ve konak, kopya numarası, 3 alanın saptanması ve 10 korunmuş tortunun varlığı. Kopya numarası için, kutu çizimi medyanı siyah çizgiyle, birinci ve üçüncü çeyrekleri menteşelerle ve minimum ve maksimumu bıyıkla gösterir. Wilcoxon testi yapıldı (n=26 vs. 39). Diğer faktörler için Fisher’s Exact testleri yapıldı.

Daha sonra aktif ve aktif olmayan TnpB sistemlerini ayırt etmek için protein merkezli analizler yaptık. Archaea’dan sadece 2 TnpB sistemi sisteme aktarıldığında aktiftir. E. coli, bakterilerden TnpB sistemleri için sayı 24’e çıkarken. tnpB lokuslarının kopya sayısı, transpozisyon aktivitelerini yansıttığından, aktif TnpB sistemleri daha yüksek kopya sayısına sahip olma eğilimindedir. Ek olarak, aktif olmayan TnpB’lerle karşılaştırıldığında, aktif TnpB’ler üç karakteristik alanı da (HTH, OrfB_IS605, ZnF) daha yüksek bir oranda (%81) kodlar. vs. %36). Protein hizalamasını inceleyerek, aktif olanları seçmek için bir kriter olabilecek aktif TnpB’lerde korunan 10 amino asit belirledik (Şekil 3).

Şekil 4 | De novo ISAam1 ve ISYmu1 TnpB sistemlerinin açıklaması ve karakterizasyonu. A, için boru hattını gösteren bir şematik de novo TnpB sistemlerinin ek açıklaması. B, İnsan HEK293T hücrelerinde 10 genomik lokusta iki TnpB sisteminin ve beş Cas nükleazın düzenleme etkinliğinin karşılaştırılması. Her nokta, üç biyolojik kopyanın ortalama etkinliğini temsil eder. Tukey’nin çoklu karşılaştırmaları ile sıradan tek yönlü ANOVA testi yapıldı (**P < 0,01; *P < 0,05). C, Şuradaki iGUIDE analiziyle ölçülen hedef dışı seviye: MAPK8 HEK293T hücrelerinde lokus. Pasta grafiği, sırasıyla hedeflenen ve hedef dışı okumaların oranını gösterir.

Belirlediğimiz rotayı takip ederek geliştirdik. de novo ek açıklama boru hattı ve işlevsel ekran için 14 potansiyel aday seçti. Bunlardan ikisi (ISAam1 ve ISYmu1), memeli hücrelerinde yüksek gen düzenleme aktivitesi gösterdi. ISAam1 ve ISYmu1 TnpB’lerin uygulama potansiyelinin derinlemesine bir değerlendirmesini yapmak için, etkinliklerini, üç Cas12fs, Nme2Cas9 ve SaCas9 içeren iyi geliştirilmiş beş küçük CRISPR-Cas editörüyle karşılaştırmalı olarak özgüllükle birlikte inceledik. Her sistem için tüm gRNA’lar, dar bir aralıkta örtüşecek şekilde tasarlanmıştır. Sonuçlar, SaCas9 ile birlikte ISAam1 ve ISYmu1 TnpB’lerin, kalan sistemlere göre nispeten yüksek aktivite ve özgüllük gösterdiğini gösterdi (Şekil 4).

IS1341 transpozon ailesini daha fazla araştırmak, IS607 ailesi ve ökaryotik TnpB’nin (Fanzor) mekanizmasını aydınlatmak, hedefleme kapsamını genişletmek ve ölü TnpB oluşturmak için TnpB sistemleri üzerindeki araştırmayı genişletmek için, özellikle kompaktlıkları göz önüne alındığında, gelecekte birkaç heyecan verici yön var. DNA metilasyon alanları gibi fonksiyonel öğelere kaynaştırarak araçlar. Özet olarak, minyatür gen editörleri olarak TnpB sistemleri, gen terapisi için büyük bir potansiyel sunar.

Referanslar:

  1. Ran, FA ve ark. Staphylococcus aureus Cas9 kullanılarak in vivo genom düzenleme. Doğa 520186-191 (2015).
  2. Edraki, A. ve ark. In Vivo Genom Düzenleme için Dinükleotid PAM ile Kompakt, Yüksek Hassasiyetli Cas9. Mol Hücresi 73714-726 e714 (2019).
  3. Kim, E. ve ark. Campylobacter jejuni’den türetilen küçük bir Cas9 ortologu ile in vivo genom düzenleme. Nat Komün 814500 (2017).
  4. Bigelyte, G. et al. Minyatür tip VF CRISPR-Cas nükleazları, hücrelerde hedeflenen DNA modifikasyonunu mümkün kılar. Nat Komün 126191 (2021).
  5. Kim, DY ve ark. Adeno-ilişkili virüs tarafından sağlanan hiper kompakt Cas12f1 ve tasarlanmış kılavuz RNA’lar ile verimli CRISPR düzenleme. Nat Biyoteknoloji 4094-102 (2022).
  6. Wu, Z. ve ark. Minyatür bir CRISPR-Cas12f nükleaz tarafından programlanmış genom düzenleme. Nat Chem Biol 171132-1138 (2021).
  7. Xu, X. ve ark. Memeli genom düzenlemesi ve düzenlemesi için tasarlanmış minyatür CRISPR-Cas sistemi. Mol Hücresi 814333-4345 e4334 (2021).
  8. Kapitonov, VV, Makarova, KS & Koonin, EV ISC, Cas9 Homologlarını Kodlayan Yeni Bir Bakteriyel ve Arkeal DNA Transpozonları Grubu. J bakteri 198797-807 (2015).
  9. Altae-Tran, H. ve ark. Yaygın IS200/IS605 transpozon ailesi, çeşitli programlanabilir RNA kılavuzlu endonükleazları kodlar. Bilim 37457-65 (2021).
  10. Karvelis, T. ve ark. Transpozon ile ilişkili TnpB, programlanabilir bir RNA-kılavuzlu DNA endonükleazdır. Doğa 599692-696 (2021).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir