Bükülme dönüşlü RNA’ların yeni bir sınıfı ve mekanizmaları nasıl keşfedilir?

Ökaryotik genom bir RNA makinesidir1ve ayırt edici yapısal ve sekans motifleri ve bunların düzenleyici mekanizmaları ile yeni kodlayıcı olmayan RNA sınıfını (ncRNA’lar) keşfetmek, bu RNA makinesinin nasıl çalıştığını anlamak için hayati önem taşır. Bu ncRNA’lar, farklı ikincil veya üçüncül yapılar ve dizi motifleri aracılığıyla düzenleyici işlevleri yürütmek için genellikle RNA bağlayıcı proteinler (RBP’ler) ile etkileşime girer. Bükülme dönüşü (K dönüşü), haberci RNA’larda (mRNA’lar) ve kodlamayan RNA’larda (ncRNA’lar) en yaygın üç boyutlu (3B) RNA yapısal motifidir.2-6. Ayrıca, K dönüşü yapısı ve bağlayıcı proteini 15.5K, RNA metabolizmasında ve patolojik süreçlerde çok önemli roller oynar.2-6. Bununla birlikte, transkriptomdaki K dönüşü yapılarının prevalansı, mekanizması ve işlevi, K dönüşü yapılarına sahip RNA’ları tanımlamak için etkili deneysel ve hesaplamalı yöntemlerin olmaması nedeniyle büyük ölçüde bilinmemektedir.

RIP-PEN-seq ve PEN-seq yöntemlerini geliştirmek için ilham kaynağı

Yaklaşık 18 yıl önce, insan genomundaki ileri K dönüşü motifleri (fktRNA’lar) ve H/ACA snoRNA’ları olan kutu C/D snoRNA’ları tanımlamak için snoSeeker yazılımını geliştirdim.7. O zamandan beri, insan genomunda gizlenmiş yeni ncRNA sınıfı olup olmadığını çok merak ediyorum. Merakımı gidermek için, 2015 yılında RNA dergisinin 20. yıl dönümünü kutlayan kıdemli RNA uzmanlarının kişisel düşüncelerini okuyarak rehberlik istedim.8. Ek olarak, öğrencileri bu düşünceleri Çinceye çevirmeleri ve Çin’deki tüm RNA araştırmacıları için bir blogda yayınlamaları için teşvik ettim. Tüm yansımalar çok mükemmel olsa da, benim için en etkili olanı Profesör Joan A. Steitz tarafından yazılmıştır.9. Joan A. Steitz, “Biri, benim RNA biyolojisinin “kara deliği” dediğim şeydir: 50 ila 300 nükleotidlik (nt) RNA’lar, derin dizileme ile analiz edilmemiştir.”9. Bu derin kavrayıştan ilham aldım ve yeni ncRNA sınıfının “kara delik” içinde saklanabileceğini varsaydım: 20 ila 1500 nt’lik (ancak 50-300 nt ile sınırlı olmayan) RNA’lar. Bu hipotezi test etmek için laboratuvarım, RNA biyolojisinin “kara deliğini” keşfetmek ve 20 ila 500 nt (hatta 1500 nt’ye kadar).

Konsensüs geriye K-dönüşü ve sekans motifleri ile yeni bir ncRNA sınıfının tanımlanması ve tanımlanması

Geleneksel RIP-seq ve RNA-seq için, imüno-çökeltilmiş RNA’lar veya uzun RNA’lar (özellikle uzunluğu >= 50 nt olan RNA’lar için) genellikle parçalandı ve ardından rastgele primer bazlı ters transkripsiyon ile RNA dizileme kitaplığı yapısına tabi tutuldu. Sonuç olarak, geleneksel RIP-seq ve RNA-seq yöntemleri, immüno-çökeltilmiş RNA’ların ve uzun RNA’ların tam uzunluğunu tanımlayamaz ve bu nedenle geleneksel RIP-seq ve RNA-seq yöntemleri, motiflerin kesin konumlarını ve konsensüs yapısal motiflerini keşfedemez. RNA’lar.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için RIP-PEN-seq/PEN-seq (Şekil 1) 15.5K proteini tarafından bağlanan herhangi bir ncRNA’nın her iki ucunu yakalamak için çift RNA adaptörleri ve boyut seçimi ve bir dizi gelişmiş deneysel strateji kullanır. Bu yeni tekniği ve yeni bir hesaplama algoritmasını (kturnSeeker) uygulayarak, önemli sayıda geri ktRNA’nın yanı sıra 600’den fazla yeni ileri ktRNA (fktRNA) keşfettik. Bu yeni geriye dönük ktRNA’ların yapısal ve sekans motifi zenginleştirme analizi yoluyla, çoğunun aşağıdaki benzersiz özelliklere sahip olduğunu bulduk: (1) geriye dönük bir K-dönüşü yapısal motifine sahipler; (2) bktRNA’ların çoğunluğunun K dönüşü yapısal motifleri, RNA 5′ ucundan ve 3′ ucundan sırasıyla 4 nt ve 2 nt’de bulunur; (3) Geriye K dönüşü yapısal motiflerin 5′ ucu CUGA motifi ve 3′ ucu UGAUG motifi içerir. Fare hücrelerine RIP-PEN-seq ve kturnSeeker kullanarak, farelerdeki bktRNA’ların bu özellikleri insan bktRNA’ları ile paylaştığını da bulduk. Ayrıca, 15.5K RIP-PEN-SHAPE-MaP yöntemlerimiz tarafından üretilen SHAPE reaktivite sinyallerinin analizi yoluyla bu benzersiz özellikleri doğruladık. Bu nedenle, bu benzersiz özelliklere dayanarak, onları konsensüs geriye K dönüşü yapısal motifleri (bktRNA’lar) ile yeni bir ncRNA sınıfı olarak adlandırdık.

Şekil 1 | Kink-turn RNA’ları tanımlamak için yeni deneysel ve hesaplamalı yöntemler. A, RIP-PEN-seq kitaplıklarının oluşturulması için prosedür. B, RIP-PEN-seq veya PEN-seq kitaplığının oluşturulması için RNase H tabanlı rRNA’ların/snRNA’ların tükenmesinin diyagramı. C, 15,5K RIP-PEN-SHAPE-MaP kitaplıklarının oluşturulması için iş akışı. D, KturnSeeker temel algoritma iş akışı. KturnSeeker, RIP-PEN-seq verilerinden ileri (fktRNA’lar) ve geri ktRNA’ları (bktRNA’lar) belirlemek ve ölçmek için geliştirildi. e, RIP-PEN-seq verilerinden tanımlanan bktRNA’nın gen modeli. F, bktRNA1’in öngörülen ikincil yapısı. G, bktRNA2’nin öngörülen ikincil yapısı.

Yüksek oranda korunmuş ve kimerik bktRNA1’in işlevi ve mekanizması

ncRNA’lar, ağırlıklı olarak, spesifik RNA molekülleri ile tamamlayıcı baz çiftleri oluşturarak işlevlerini yerine getirir.9. Bu RNA-RNA baz eşleşmesi kavramına dayanarak9starBase platformunu geliştirdik10, 11, Google Akademik’te 15000’den fazla alıntı yapılmıştır. Bu platform, RNA-RNA interaktomunun kodunu çözmek için neredeyse tüm genel CLIP, CLASH ve PARIS sıralama verilerini entegre eder.10, 11. starBase’imizde geliştirilen araçları kullanarak, 15.5K ve FBL CLASH ve PARIS sıralama verilerindeki kimerik okumaları analiz ettik ve U12 snRNA’nın bktRNA1’in doğrudan hedefi olduğunu keşfettik. RMBase platformumuzu kullanarak BktRNA1’in U12 snRNA’nın A8’inin 2′-O-metilasyonu için vazgeçilmez olduğunu da bulduk.12, kızılötesi primer uzantısı (irPE) ve fonksiyon kazanımı ve kaybı deneyleri. bktRNA1’in tükenmesi, U12 tipi intronların %75’inden fazlasını etkiledi; tutulan intronların en az %37’si, U12 snRNA’daki bktRNA1 ve Am8’in insan hücrelerinde U12 tipi eklemenin doğruluğu için çok önemli olduğunu gösteren önemli değişikliklere sahipti (P ​​değeri <0.05). Ayrıca, bktRNA1 tarafından yönlendirilen U12 snRNA'da A8'de 2'-O-metilasyonun, ZCRB1'in U11-U12 di-snRNP kompleksine alınması ve ayrıca Northern Blot kullanılarak U12 tipi intronların eklenmesi için kritik olduğunu doğruladık. ChIRP,RNA açılan ve RNA EMSA deneyleri (İncir. 2).

2 | Konsensüs geriye K dönüşü yapısal motifleri (üst panel) ile yeni bir ncRNA sınıfının nasıl tanımlanacağını aydınlatan iş akışı. bktRNA’ların fonksiyonlarını ve mekanizmalarını gösteren önerilen model (alt panel).

Konsensüs geri K-dönüşü yapısal motiflerin potansiyel işlevi

Geriye doğru K-dönüşü yapısal motiflerinin, ana düzenleme teknolojisi ve GFP raportörleri kullanılarak bktRNA’lar tarafından intron eklenmesinin yerel düzenlenmesi için vazgeçilmez olduğunu gösterdik (İncir. 2). Ayrıca, bktRNA’ların bu geriye dönük K-dönüşü yapısal motiflerinin, eksonükleazlar tarafından bozulmayı önlemek, bktRNA’ların işlenmesi ve olgunlaşması için vazgeçilmez olduğunu da bulduk. Kutu C/D fktRNA’ların (fktRNA’lar) aksine, CUGA motifi geriye doğru K dönüşü motiflerinin 5′ ucundadır, bu nedenle geriye K dönüşü motifleri fonksiyonel bölgeleri seçmek için bir işaretleyici olarak kullanılmayabilir, bunun yerine bir RNA’yı stabilize etmek için yapısal eleman. İlginç bir şekilde, daha önce Joan A. Steitz’in laboratuvarı tarafından keşfedilen bir ncRNA’da bir konsensüs geriye dönük k-dönüşü yapısal motifi belirledik; bu, 5′ ucunun neden ekzonükleazlar (yayınlanmamış veriler) tarafından bozulmadığına dair uzun süredir devam eden şüpheyi açıklıyor. Bu bulgular, bktRNA’ların stabilizasyonu, biyogenezi ve işlevi için konsensüs geriye K dönüşü yapısal motifinin önemini güçlü bir şekilde desteklemektedir.

Sıradaki ne?

Çalışmamız, daha fazla açıklama gerektiren bu yeni bktRNA sınıfıyla ilgili birçok ilgi çekici bilimsel soruyu gündeme getirdi. Örneğin, geriye doğru K-dönüşü yapısal motiflerinin sırasıyla RNA 5′ ve 3′ uçlarından 4 nt ve 2 nt’de konumlandırılmasını yöneten temel mekanizmalar nelerdir? Diğer bktRNA’lar, ac4C modifikasyonuna aracılık eden U13 box C/D fktRNA gibi 2′-O-Me modifikasyonuna veya diğer modifikasyon türlerine rehberlik etme işlevi görüyor mu? Ek olarak, 5′ CUGA ve 3′-UGAUG motiflerinin konsensüs geriye doğru K-dönüşü yapısının merkezi bileşenleri olarak seçilmesine hangi faktörler katkıda bulunur? bktRNA ile fktRNA ve 15.5K proteini arasındaki etkileşim için farklı yapısal temeller ve moleküler mekanizmalar var mıdır? Bağlayıcı protein 15.5K dışında, geriye doğru K dönüşü yapısal motifi ile başka hangi proteinler etkileşime girebilir? Eşsiz geriye doğru K-dönüşü yapısı omurgalılara mı özeldir yoksa böcekler, nematodlar, bitkiler ve arkeler gibi diğer organizmalar da benzer özelliklere sahip midir? BktRNA1’in aracılık ettiği U12 snRNA’daki 2′-O-Metilasyonun böcekler, nematodlar, bitkiler ve arkeler gibi diğer organizmalarda da var olup olmadığı? Tanımladığımız 650’den fazla yeni fktRNA’nın biyolojik işlevleri nelerdir? KtRNA’ların aracılık ettiği majör splicesome’un snRNA’ları üzerindeki 2′-O-Metilasyon, U2 tipi intronların eklenmesini de etkiler mi? İnsanlarda ve diğer organizmalarda gizlenmiş yeni ncRNA sınıfları var mı?

ncRNA’ların Çalışmasını Yeniden Ziyaret Etmek

Çalışmamız, ncRNA’ların incelenmesi için aşağıdaki gibi bazı yenilikçi kavramlar sunmaktadır: 1. ncRNA araştırmasının odak noktası, uzunluğu 50 nt’den az olan küçük RNA’larla (örn. miRNA’lar ve piRNA’lar) sınırlandırılmamalı, bunun yerine geniş bir uzunluk aralığına (20-1500 nt) sahip çeşitli yapısal ncRNA tiplerini içermelidir. 2. Dizileme yoluyla yalnızca ncRNA’ların ifadesini incelemek yerine, ncRNA’ların hem ifade düzeyini hem de kesin tam uzunluktaki dizisini aynı anda araştırmayı öneriyoruz. 3. ncRNA’ların birincil sekansını incelemeye ek olarak, fonksiyonlarını ve mekanizmalarını tam olarak anlamak için sekans motiflerini, ikincil ve üçüncül yapısal motifleri keşfetmek önemlidir. Nihayet, Bu yenilikçi kavramlar ve yöntemlerimiz (RIP-PEN-seq, PEN-seq ve RIP-PEN-SHAPE-MaP), çeşitli organizmalarda yeni ncRNA sınıfını keşfetmek ve ncRNA’ların rollerini ve temel mekanizmalarını keşfetmek için birleştirilebilir ve böylece bizim zenginleştirmemizi sağlar. RNA moleküllerinin anlaşılması.

Özetle, bulgularımız yeni bir küçük RNA sınıfını karakterize ediyor ve bktRNA’lar arasında karışma, RNA ekleme ve RNA metilasyonunu içeren başka bir gen ekspresyonu düzenleme katmanını ortaya çıkarıyor. Bu çalışmanın, diğer bktRNA’ları veya ncRNA’ları keşfetmek ve bunların hücre ve hastalıklardaki fonksiyonlarını ve mekanizmalarını çözmek için yeni yollar sağlayacağını tahmin ediyoruz.

Referanslar

  1. Amaral, PP, Dinger, ME, Mercer, TR & Mattick, JS Bir RNA makinesi olarak ökaryotik genom. Bilim 3191787-1789 (2008).
  2. Klein, DJ, Schmeing, TM, Moore, PB & Steitz, TA Kink-turn: yeni bir RNA ikincil yapı motifi. EMBO J 204214-4221 (2001).
  3. Lilley, DM Ribosviçlerdeki ve diğer RNA türlerindeki K dönüşü motifi. Biochim Biophys Açta 1839995-1004 (2014).
  4. Schroeder, KT, McPhee, SA, Ouellet, J. & Lilley, DM RNA’daki k dönüşü motifleri için yapısal bir veritabanı. RNA 161463-1468 (2010).
  5. Edery, P. ve ark. TALS gelişimsel bozukluğunun küçük ekleme bileşeni U4atac snRNA’daki kusurla ilişkisi. Bilim 332240-243 (2011).
  6. O, H. ve ark. Gelişimsel bozukluk MOPD I’de minör spliceosome’un bir bileşeni olan U4atac snRNA’daki mutasyonlar. Bilim 332238-240 (2011).
  7. Yang, JH ve ark. snoSeeker: insan genomundaki kılavuz ve yetim snoRNA genlerinin taranması için gelişmiş bir hesaplama paketi. Nükleik Asitler Res 345112-5123 (2006).
  8. Nilsen, TW Yirmi yıllık RNA: o zaman ve şimdi. RNA 21471-473 (2015).
  9. Steitz, J. RNA-RNA baz eşleşmesi: tema ve varyasyonlar. RNA 21476-477 (2015).
  10. Yang, JH ve ark. starBase: Argonaute CLIP-Seq ve Degradome-Seq verilerinden microRNA-mRNA etkileşim haritalarını keşfetmek için bir veritabanı. Nükleik Asitler Res 39D202-209 (2011).
  11. Li, JH, Liu, S., Zhou, H., Qu, LH & Yang, JH starBase v2.0: büyük ölçekli CLIP-Seq verilerinden miRNA-ceRNA, miRNA-ncRNA ve protein-RNA etkileşim ağlarının kodunu çözme. Nükleik Asitler Res 42D92-97 (2014).
  12. Xuan, JJ ve ark. RMBase v2.0: epitranskriptom sıralama verilerinden RNA modifikasyonlarının haritasının deşifre edilmesi. Nükleik Asitler Res 46D327-D334 (2018).

Bir yanıt yazın

E-posta adresiniz yayınlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir